论文总结
1、针对目前很多radiomics工作，只做分类，只看AUC，缺少病理学验证。作者用histology验证radiomics biological meaning。
2、主要是机制创新，建立了radiomics和histology的biological linkage。
摘要
放射组学在神经退行性疾病方面取得了长足的进展。然而，以往的研究仅探讨了放射组学在临床应用的可行性。因此，本研究的目的是获得与髓鞘蛋白衰老变化最相关的放射组学特征，并将其诊断性能与扩散张量成像(DTI)参数进行比较，以确定这些特征作为评估脑老化的成像生物标志物的可靠性。30只中年小鼠和30只老年小鼠被分配到训练组，以探索髓鞘蛋白的最相关特征及其诊断性能。10只中年小鼠和10只老年小鼠被分配到测试组，以进一步验证特征的重复性。进行T2加权成像和DTI，获得脑白质放射组学特征和DTI参数。免疫荧光染色检测大鼠全脑、皮质、穹隆、纹状体和前连合的髓鞘蛋白，包括蛋白脂蛋白(PLP)和髓鞘碱性蛋白(MBP)。皮尔逊相关分析用于观察放射组学特征与髓鞘蛋白的相关性。选取相关系数最高的4个特征与DTI参数，包括分数各向异性(FA)、平均扩散系数(MD)、轴向扩散系数(AxD)和径向扩散系数(RD)，比较它们的诊断性能。小波-hll_glszm_ZoneEntropy、小波-hll_gldm_DependenceEntropy、小波-lhl_glszm_ZoneEntropy和log-sigma-2-0-Mm3d_gldm_DependenceEntropy是与PLP最相关的四个特征，与PLP具有中等显著的相关性。四种特征的受试者工作特征曲线下面积在训练集中分别为0.940、0.917、0.831和0.964，在测试集中分别为0.880、0.840、0.860和0.880。FA、MD、AXD和RD的AUC在训练集中分别为0.864、0.743、0.673和0.778，在测试集中分别为0.780、0.710、0.670和0.730。这些结果表明，白质的放射组学特征与髓鞘蛋白具有显著的相关性，其表现与DTI参数相当甚至更好，从而保证了它们作为评估脑老化的无创性成像生物标志物的可靠性。
引言
大脑老化是一个不可避免的自然过程。在整个衰老过程中，认知功能下降，同时增加了对神经退行性疾病的易感性(Wyss-Coray，2016；Harada等人，2013年)。因此，这导致生活质量下降和社会负担增加。在大脑老化的过程中，髓鞘神经纤维发生了变化，主要是主要致密线的分裂和"气球"的形成(Feldman和Peters，1998；Attia等人，2019年)。这些病理变化导致神经元之间失去有效的通信，并导致与年龄相关的认知下降(Fields和Bukalo，2020；Graciani等人，2023)。蛋白质脂蛋白(PLP)和髓鞘碱性蛋白(MBP)是两种最丰富的髓鞘蛋白，都是评估髓鞘丢失程度的特异和敏感的指标(Jahn等人，2009；Jahn等人，2020)。PLP是一种膜蛋白，它将髓磷脂片层粘连在一起，促进髓鞘致密，在维持髓鞘稳定和支持轴突-髓鞘代谢方面发挥关键作用(RosenBluth等人，2006年；Ruskamo等人，2022)。MBP是一种膜嵌入蛋白，对髓鞘致密和髓鞘形成是必不可少的，它形成了一种分子屏障，阻止多余的细胞质和膜结合的蛋白质进入髓磷脂片层之间的间隙(Aggarwal等人，2011年；Boggs，2006年)。弥散张量成像(DTI)作为一种非侵入性成像诊断方法，可以可视化和量化白质纤维束，有助于评估神经损伤并帮助诊断神经遗传性疾病(Sajjadi等人，2013；Y Chen等人，2023)。然而，DTI检查不是常规脑磁共振成像(MRI)检查的一部分。如何通过传统的MRI图像方便地观察脑老化过程中脑白质的变化？无线电MICS是一种可以从常规图像中提取定量和可挖掘信息的方法，通常用于区分疾病(Bera等人，2022；Mayerhoefer等人，2020)。它有望应用于大脑老化，为预测认知功能的变化奠定基础。放射组学在诊断和预测神经退行性疾病方面取得了长足的进展，主要包括阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)。沙希迪等人的研究成果。系统地回顾了13项关于AD、轻度认知障碍(MCI)和正常受试者的研究(沙希迪等人，2023)。MRI放射组学对区分AD与正常人的敏感性和特异性分别为0.92和0.91，对MCI的敏感性和特异性分别为0.74和0.79，对AD和MCI的敏感性和特异性分别为0.73和0.79。Bian等人。分析了28篇文章，并报道了放射组学具有出色的表现，在预测PD方面的综合敏感性和特异性分别为0.91和0.93，在区分PD和非典型帕金森综合征方面分别为0.86和0.80(Bian等人，2023)。这些研究探索了放射组学在临床应用的可行性。然而，目前尚不清楚放射组学特征是否有潜在的组织学基础，或者更准确地说，这些特征与组织学变化之间是否存在可能的关系，以及这种关系是否可以支持放射组学特征预测脑老化，实现与DTI相当甚至更好的表现。因此，本研究旨在获得髓鞘蛋白中与衰老变化最相关的特征，并将其诊断性能与DTI参数进行比较，从而确定这些特征作为评估脑老化的成像生物标志物的可靠性。
材料和方法
动物
80名中年人(11-12个月)和老年人(18-19个月)老年)C57BL/6J小鼠作为研究对象。将30只中年小鼠和30只老年小鼠分配到训练集，以获得髓鞘蛋白的最相关特征及其诊断性能。10只中年小鼠和10只老年小鼠被分配到测试组，以进一步验证特征的重复性。所有程序均经医院实验动物管理和伦理委员会批准，根据《实验动物护理和使用指南》执行，并符合《到达指南》。
图2.训练组中、老年小鼠PLP和MBP的代表性图像和H评分。A，中老年(n=30)和老年(n=30)小鼠大脑皮质PLP和MBP的代表性图像及其PLP H-Score(p=0.002)和MBP H-Score(p=0.101)的差异；b，中老年(n=30)和老年(n=30)小鼠痂体内PLP和MBP的代表性图像及其PLP H-Score(p<；0.001)和MBP H-Score(p=0.003)的差异；(3)中老年(n=30)与老年(n=30)纹状体内PLP、MBP的代表图像及其H值(p=0.008)和H值(p=0.014)的差异；(D)中老年(n=30)与老年(n=30)前连合的PLP、MBP的代表图像及其H值(p<；0.001)和H值(p=0.152)的差异。PLP，蛋白脂蛋白；MBP，髓鞘碱性蛋白。左侧是中年小鼠的代表性图像，右侧是老年小鼠的代表性图像。用Mann-Whitney U检验比较除纹状体PLP(独立样本t检验)外，中老年人(n=30)与老年人(n=30)之间PLP和MBP的差异。P<；0.05表示有显著差异。
图3.训练组中年(n=30)和老年(n=30)小鼠的FA、MD、AxD和RD的差异。A，中年(n=30)和老年(n=30)小鼠的代表性DEC图谱；b，中老年(n=30)和老年(n=30)小鼠的FA、MD、AxD和RD图像；c，中老年(n=30)和老年(n=30)小鼠的FA、MD、AxD和RD值的小提琴曲线图。FA，分数各向异性；MD，平均扩散系数；AXD，轴向扩散系数；RD，径向扩散系数。对于FA、MD和AxD，采用Mann-Whitney U检验比较中老年(n=30)和老年组(n=30)之间的差异，对于RD采用独立样本t检验。P<；0.05表示有显著差异。
MRI
80只小鼠在氧气通风下用1-1.5%的异氟醚气体麻醉，并使用专为小鼠成像而设计的16厘米射频线圈放置在磁场的中心区域。然后在Bruker AV3HD 500 MHz 11.7T小型动物磁共振扫描仪上进行MRI检查。T2加权成像(T2WI)采用稀有序列，设置如下：回声时间/重复时间(TE/TR)=26/3000ms，矩阵大小=256×256，视野=18×18mm2，45层，层厚0.3 mm。DTI采用DtiEpi多激发序列，TE/tr=20/3500ms，矩阵大小=150×150，视野=18×18mm2，轴位45层，层厚=0.3 mm，b值=1000 S/mm2，段=4，带宽=2778 Hz/像素。DTI中脂肪抑制处于开启状态。扫描前，用耳钉和咬条固定小鼠，并在它们的腹部贴上胶带，以减少呼吸运动的幅度。运动校正是在预处理过程中进行的。T2WI、弥散张量成像(b=0 S/mm~2)和弥散张量成像(b=1000 S/mm~2)的平均信噪比分别为29.137±2.103、29.298±2.321和17.303±1.816。采用DSI Studio软件对DTI数据进行分析。分数各向异性(FA)，获得全脑的平均扩散系数(MD)、轴向扩散系数(AxD)和径向扩散系数(RD)值。
髓鞘蛋白
训练组60只小鼠经腹膜内深度麻醉(戊巴比妥钠50 mg/kg体重)，然后用磷酸盐缓冲盐水经心脏灌流，然后用4%多聚甲醛灌流。在即刻断头后，取脑，在室温下用4%多聚甲醛固定，然后用于荧光免疫组织化学。在距Bregma 1.09 mm至0.37 mm处(距Bregma 1.09 mm至0.37 mm)切取每只小鼠大脑的冠状面，用于髓鞘蛋白的测量(Paxinos和Franklin，2013)。髓鞘的主要成分PLP和MBP被染色。荧光免疫组织化学的步骤在补充方法1中描述。基于上述每个小鼠的二维冠状组织切片。使用3D HISTECH数字病理图像扫描仪以20倍的放大倍数获取多重荧光免疫组织化学图像的概述图像。AP-Time图像分析软件(3D Medicines Inc.)在Brightfield的基础上，检测了整个大脑、皮质、胼胝体、纹状体和前连合的阳性表达。两位经验丰富的研究人员通过参数设置对染色强度(弱阳性区、中阳性区、强阳性区)进行了分级。输出指标为H-Score(H-Score=弱阳性区百分率×1+中等阳性区百分率×2+强阳性区百分率×3)。用组内相关系数(ICC)计算结果的一致性，以H分的平均值作为最终结果。
放射组学特征
放射组学特征是从医学图像中提取和分析的定量信息，通过各种数学公式计算(Zwanenburg等人，2020)。形状特征可以定量地描述感兴趣区域的几何特征，一阶特征可以描述体素强度值的分布，二阶特征可以描述灰度值的空间分布和每个体素之间的关系。在一阶和二阶特征的基础上加入高斯拉普拉斯和小波等滤波器会提取出更复杂的信息。近年来，放射组学特征经常被应用于基于小鼠T2WI图像的肿瘤治疗变化的反映，该图像显示了出色的检测能力(Eresen等人，2020；G Yu等人，2024)。在本研究中，经验丰富的研究人员首先将小鼠的T2WI图像导入ITK-SNAP软件，勾勒出整个大脑的轮廓，然后导入SPM 12进行骨和软组织切除。之后，用SPM12自动获得小鼠脑白质的节段。由于自动分割中存在最外轮廓，研究人员使用ITK-SNAP软件手动将其删除。此外，如果需要，研究人员将对自动分割进行其他手动校正，以获得高质量的。最后，将整个脑图像和最终正确的白质分割放在一起放入PyRadiology(3.0版)中，用于白质的放射组学特征提取(Zwanenburg等人，2020；van Griethuysen等人，2017)。特征提取的流程图如图1所示。在本研究中，提取的1132个特征包括原始特征(形状、一阶和二阶)、高斯滤波的拉普拉斯特征(一阶和二阶)和小波滤波特征(一阶和二阶)。训练的目标是找到与髓鞘蛋白最相关的特征。因此，在训练过程中，每个特征都与整个大脑、皮质、胼胝体、纹状体和前连合的MBP和PLP的H-分数进行了相关分析。这产生了10个核心相关系数，从中选出最大的绝对相关系数，并与其他特征的绝对相关系数进行比较。最后，四个相关系数最高的特征被确定为最相关。然后，从测试集中的T2WI图像中提取所选特征的值。最后，在训练和测试集中计算这些特征的接收器工作特征曲线(AUC)值下的面积，一起观察这些特征的诊断性能，并与DTI参数进行比较。
统计
采用SPSS(Version 25.0)和Microsoft Excel2020进行统计分析。小于0.05的双尾p值被认为具有统计学意义。使用Shapiro-Wilk检验来评估数据是否服从正态分布，p值大于0.05表示正态分布。分别用独立样本t检验和Mann-Whitney U检验比较正态分布和非正态分布。采用Pearson相关分析，观察放射组学特征与训练集髓鞘蛋白的相关性。使用DeLong测试来比较训练和测试集中所选特征和DTI参数之间AUC的诊断性能差异。
结果
髓鞘蛋白与DTI
髓鞘蛋白的H分数测量结果如表1所示。PLP和MBP的代表性图像和H分数如图2所示。老年小鼠全脑、皮质、胼胝体、纹状体和前连合的H分数显著低于中年小鼠。老年小鼠的大脑皮质、大脑皮质和前连合的MBP评分显著低于中年小鼠，而在整个大脑、皮质和前连合中无显著差异。随着年龄的增加，FA值显著降低，MD、AxD和RD值显著增加(图3)。
放射组学特征与髓鞘蛋白的相关性
图4显示了最大绝对相关系数大于0.50的特征，并且这些放射组学特征与髓鞘蛋白之间的相关性的p值如表S1所示。小波-hll_glszm_ZoneEntropy、小波-hll_gldm_DependenceEn tropy、小波-lhl_glszm_ZoneEntropy和log-sigma-2-0-mm3D_gldm_DependenceEntropy的相关系数最高，分别排在前四位。对于小波HLLGLZMZM-ZoneEntropy，它与−(r=−0.66)、前连合(r=−0.63)、全脑(r=−0.49)、纹状体(r=−0.34)和皮质(r=0.34)的PLP评分呈显著负相关。小波-HLLGLDM-DependenceEntropy与−(r=−0.66)、前连合(r=−0.5 9)、全脑(r=−0.5 1)、纹状体(r=−0.40)、皮质(r=0.33)等脑区PLP评分呈显著负相关。小波-lhl_glszm_ZoneEntropy与大脑皮质PLP评分呈显著负相关(r=−0.64)、前连合(r=−0.56)、全脑(r=−0.44)、纹状体(r=−0.31)和皮质(r=−0.29)。Log-sigma-2-0-Mm3d_gldm_DependenceEntropy与前连合(r=−0.62)、穹隆体部(r=−0.59)、全脑(r=−0.47)、皮质(r=−0.41)的H值呈显著负相关。这四个特征与髓鞘蛋白的相关散点图如图所示。S1-S4。所有1132个放射组学特征与髓鞘蛋白之间的相关热图如图所示。中五至中八。此外，DTI参数与髓鞘蛋白之间的相关性如表S2所示。
放射组学特征与DTI参数的比较
训练集中小波HLLGLZM_ZoneEntropy、小波HLLGLDM_DependenceEntropy、小波LHL_GLSDZM_ZoneEntropy和LOG-Sigma-2-0-mm-3D_GLDM_DependenceEntropy的AUC值分别为0.940、0.917、0.831和0.964，测试集中的AUC值分别为0.880、0.840、0.860和0.880(图5A，c)。FA、MD、AXD和RD的AUC在训练集中为0.864、0.743、0.673和0.778，在测试集中为0.780、0.710、0.670和0.730(图5B，d)。训练和测试集中放射组学特征的详细性能分别显示在表3和表3中。DTI参数在训练和测试集中的详细性能分别见表4和S4。在训练集中，小波HLL_glszm_ZoneEntropy、小波-Hll_gldm_DependenceEntropy和log-sigma-2-0-mm-3D_gldm_DependenceEntropy的AUC显著高于MD、AxD和RD的AUC(p<；0.05)。这四个特征的AUC与FA相似(p>；0.05)。在测试集中，四个特征的AUC与FA、MD、AxD和RD的AUC之间没有显著差异(p>；0.05)。
讨论
在这项脑老化研究中，我们观察到白质的放射组学特征与髓鞘蛋白有显著的相关性。小波HLL_glszm_ZoneEntropy、小波-Hll_gldm_DependenceEntropy、小波-LHL_glszm_ZoneEntropy和log-sigma-2-0-mm 3D_gldm_DependenceEntropy表现出与DTI参数相当甚至更好的性能。髓鞘蛋白在识别脱髓鞘和神经退行性疾病方面发挥着关键作用(Elitt等人，2020年；Owens等人，2023年；严氏等人，2021年)。在我们的研究中，随着年龄的增加，整个大脑、皮质、胼胝体、纹状体和前连合的PLP显著降低。对于MBP，虽然各部位随年龄增长而降低，但只有胼胝体和纹状体有统计学差异。这可能表明PLP的下降是显著的，并且在脑老化过程中广泛存在，而MBP的减少很小，而且是局部性的。DTI参数可反映白质纤维束的完整性和髓鞘损伤情况。许多基于人类和小鼠的研究表明，在认知衰退疾病中，FA减少，MD、AXD和RD增加(Mayo等人，2018年；StˇEP'an-Buksakowska等人，2012年；泽比等人，2013年)。我们的研究表明，与中年小鼠相比，老年小鼠的FA值显著降低，MD、AxD和RD值显著升高。髓鞘成像方法主要包括DTI、髓鞘水成像和磁化转移成像(Alonso-Ortiz等人，2015；SLED，2018)。DTI是一种广为人知的检查方法，常用于各种研究。因此，在本研究中，将DTI与放射组学表现进行了比较。然而，在这两个数据集中，DTI参数的AUC值略低于放射组学特征的AUC值。这反映了DTI在髓鞘成像方面的一些不足。除了检测髓鞘损伤的程度外，DTI指标还受到非髓鞘因素的影响(Kholi等人，2023)。此外，在交叉或复合纤维中，DTI参数和髓鞘之间的关系也降低(Figley等人，2021)。选择放射组学特征的常用方法主要是降维，用于确定对临床问题最具预测性或分类的特征(X Yu等人，2024；Wang等人，2023；Yang等人，2022)。本研究的目的是探索与髓鞘蛋白最相关的特征的诊断能力。因此，我们选择了与髓鞘蛋白相关系数最高的四个特征，这强调了放射组学和组织学之间的潜在关系。放射组学是一种新兴的方法，常用于识别和预测认知衰退疾病。尽管基于老化的人脑MRI图像构建了上述放射组学模型，但尚未研究脑老化中的组织学变化与放射组学特征之间的潜在和间接关系(Shasidi等人，2023；Tang等人，2021；Cheung等人，2022)。以反映髓鞘损伤程度的髓鞘蛋白作为参照物，观察其与1132个放射组学特征的相关性，从而获得与四个DTI参数进行诊断性能比较最相关的四个特征。我们发现所有四个特征都属于熵的范畴，这是图像异质性的一个指标(Kim等人，2017；YH Chen等人，2023)。值越大，图像的异质性越高。在老年小鼠中，四种放射组学的值有显著的增加。随着大脑的老化，研究表明髓鞘蛋白减少，正常的髓鞘结构解体，同时，异常蛋白质以及包涵体和功能障碍的溶酶体积累，导致组织结构紊乱和组织学异质性增加(Wyss-Coray，2016；Feldman和Peters，1998；Attia等人，2019；Ruskamo等人，2022；Boggs，2006)。在本研究中，髓鞘蛋白的四个最相关的特征反映了图像的异质性，这在一定程度上证实了放射组学间接揭示组织学异质性的能力，并加强了利用放射组学特征检测脑白质变化的可信度。放射组学从医学图像中提取定量特征，并将成像数据转换为可利用的数据。所获得的量化特征不是研究对象的固有属性，但它们可以与其他属性建立联系，反映图像内的信息。在本研究中，这四种特征对脑老化的诊断表现良好，AUCS超过0.80，表现出与DTI参数相当甚至更好的性能，表明这四种特征作为无创性脑老化评估的成像生物标志物具有良好的可靠性。未来，可以从老化的人脑MRI图像中提取这四个特征，以评估其诊断性能。此外，这些特征可以与人类的其他衰老生物标志物联系起来并结合起来，以确定更有效的指标。
我们的研究还存在一些局限性。首先，样本量相对较小。这在实验研究中很常见，但可能会限制对更有意义的信息的挖掘。其次，我们选择了整个大脑和四个有代表性的脑区进行髓鞘蛋白的测量，更多的脑区将更好地提供更多的统计信息。第三，由于T2WI序列能够清晰地显示小鼠脑组织的结构，因此本文提取了基于T2WI序列的放射组学特征。来自其他MRI序列的特征也可能与髓鞘蛋白有显著的相关性。最后，有许多实验方法和软件可用于提取特征、测量DTI参数和评估髓鞘蛋白。因此，更多样化的研究可以在未来进一步验证我们的发现的泛化能力。
图5。放射组学特征和DTI参数的性能。A、c分别显示了训练集和测试集的放射组学特征的AUC。B，d分别表示训练集和测试集的DTI参数的AUC。特征1，小波-HLL_glszm_ZoneEntropy；特征2，小波HLL_gldm_DependenceEntropy；特征3，小波-LHL_glszm_ZoneEntropy；特征4，log-sigma-2-0-mm-3D_gldm_DependenceEntropy。Fa，分数各向异性；MD，平均扩散系数；AxD，轴向扩散系数；RD，径向扩散系数；AUC，接收器工作特性曲线下面积。放射组学特征和DTI参数的AUC值分别基于整个脑白质结构和整个脑白质纤维束。
结论
脑白质的放射组学特征与髓鞘蛋白显著相关，其表现可与DTI参数相媲美或超过，显示其作为无创性脑老化生物标志物的巨大潜力和可靠性。