Dot blot 实验注意事项

01

实验原理

将含有目标分泌型蛋白的样品直接点在固相载体（如 PVDF 膜）上，使蛋白质吸附在膜表面。随后，利用特异性抗体识别并结合目标蛋白。一抗与目标蛋白结合后，再通过与二抗结合，二抗通常连接有酶或荧光标记物。最后，通过化学发光底物反应或荧光检测等可视化手段，根据显色信号的有无和强度来判断目标蛋白是否存在以及相对含量。

02

实验步骤

1. 裁剪与活化 PVDF 膜：根据血清数量和样品数量，将 PVDF 膜裁剪成长方形，并减去一个小角作为起始标记。使用甲醇浸泡 PVDF 膜 1 分钟，随后转移到 TBST 中浸泡 15 分钟。

   

2. 晾干 PVDF 膜：取出 PVDF 膜，置于干净自封袋上，晾干至半干状态，即看到水膜消失即可。（晾干可以使 PVDF 膜表面的水分或溶液挥发，使样品中的蛋白质更紧密地吸附在膜上，从而增强结合能力，防止样品在后续操作中移动或扩散。）

3. 点样：将样品点于每格的中央，控制样品蛋白浓度在 2mg/mL，每点 1μL，室温晾干。

   

4. 封闭：将 PVDF 膜浸入含 5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液中，用量以浸没为准，室温下摇床放置 1 小时。

5. 洗涤：回收封闭液，使用 TBST 溶液清洗 PVDF 膜 5 次，每次 5 分钟。

6. 一抗孵育：加入稀释后的一抗，确保 PVDF 膜被溶液完全浸没，4℃摇床孵育过夜。

7. 洗涤：回收一抗，使用 TBST 溶液清洗 PVDF 膜 5 次，每次 5 分钟。

8. 二抗孵育：用含 2% 脱脂奶粉的 TBST 溶液以 1：5000 的比例稀释二抗，确保 PVDF 膜被溶液完全浸没，室温孵育 1.5 小时。

9. 洗涤：回收二抗，使用 TBST 溶液清洗 PVDF 膜 5 次，每次 5 分钟。

10. 显色：将 ECL 超敏显色剂（A 液：B 液 =1：1）混匀后，按适当体积滴加至 PVDF 膜上，室温反应 10 秒后显色，提前将化学曝光仪预冷，进行曝光，观察并记录结果。