一、问题定义
在抗体工程领域，从naïve文库筛选获得的纳米抗体通常存在亲和力不足的问题。传统的亲和力成熟策略------如丙氨酸扫描、定点饱和突变、CDR随机化------往往依赖大规模筛选，缺乏清晰的结构指导原则。Mikolajek等2022年发表于PNAS的文章提出并验证了一个核心假说：纳米抗体-靶标复合物的构象熵（conformational entropy） 与结合亲和力之间存在可量化的正相关关系。
二、关键实验体系
2.1 文库来源与筛选流程
研究团队使用了来源于Abcore Inc.的abcore 纳米抗体文库（噬菌体展示VHH文库）。筛选策略为：
- 第一轮：50 nM生物素化RBD，Dynabeads M-280磁珠捕获
- 第二轮：5 nM RBD，选择性富集
- 获得亲本VHH：H11（阻断ACE2-RBD相互作用）
2.2 亲和力成熟文库构建
通过PCR对H11的CDR3区域进行随机突变，构建了约2×10⁹独立克隆的突变体文库。采用5 nM和1 nM RBD进行两轮严紧淘选，最终获得5个成熟变体：H11-A10、H11-H6、H11-B5、H11-D4、H11-H4。
三、实验方法与技术路线
3.1 结构解析
- X射线晶体学（Diamond Light Source I03线站）
- 冷冻电镜单颗粒分析（Titan G2 + Bioquantum-K3）
- 数据处理：Relion → RefMac5（CCP-EM GUI）/Phenix real space refinement
3.2 结合力与热力学表征
- SPR（Biacore T200，Protein A sensor chip/Biotin CAPture kit）
- ITC（iTC200 Micro-Calorimeter，25°C）
- 热稳定性测定（NanoTemper Prometheus NT.48，15-95°C升温）
3.3 构象熵计算------EMMI方法
EMMI（Electron Microscopy Metainference）是一种贝叶斯方法，将先验信息与冷冻电镜实验数据结合，对结构系综进行建模。具体实现：
- 将实验体素图用高斯混合模型（GMM）表示
- 使用GROMACS-2018.6进行NPT/NVT分子动力学平衡
- 通过PLUMED 2.6.0-dev执行EMMI模拟
- 沿RMSD构建自由能景观，计算均方根涨落（RMSF）
四、核心结果
| 变量 | 结合RBD的KD (nM) |
|---|---|
| H11（亲本） | 微摩尔级（弱） |
| H11-H4（最优成熟变体） | -33 nM |
| H11-D4 | -24 nM |
| D4 hybrid（设计变体） | -18 nM |
- RMSF与KD的Pearson相关系数 r = 0.85，P = 0.004
- Schlitter熵法的相关系数 r = 0.75，P = 0.019
- D4 hybrid的冷冻电镜结构显示80% one-up-two-down / 20% two-up-one-down的动态构象
五、技术启示
本研究验证了一条可落地的纳米抗体理性设计技术路线：从abcore 纳米抗体文库筛选 → 结构解析 → EMMI构象系综建模 → 构象熵-亲和力相关性分析 → 基于熵最小化原则的定点突变设计。这套方法的通用性意味着它可迁移至其他靶标的纳米抗体开发项目中，为抗体工程提供了一项基于结构动力学的全新设计指标。
参考文献：
Mikolajek, H. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119(31):e2205412119. DOI: 10.1073/pnas.2205412119