Plant-Based Production of Human Major Histocompatibility Complex Class II Molecules
植物源表达人主要组织相容性复合体 II 类分子
1 引言
主要组织相容性复合体（MHC）蛋白是高等脊椎动物适应性免疫系统的核心组分（Hughes & Yeager, 1998）。MHC I 类分子广泛表达于绝大多数有核细胞，负责激活 CD8⁺细胞毒性 T 细胞；而 MHC II 类分子主要表达于树突状细胞、巨噬细胞、B 细胞等专职抗原呈递细胞，激活 CD4⁺T 细胞。活化的 CD4⁺T 细胞分泌细胞因子，协同调控细胞免疫与体液免疫应答（Neefjes et al., 2011）。微生物入侵时，抗原呈递细胞内吞病原体，将抗原肽段与 MHC 蛋白形成复合体展示于细胞膜表面；T 细胞识别该复合体，启动抗原特异性免疫反应（Hoeks et al., 2022; Pishesha et al., 2022）。
结构上，MHC I 与 MHC II 均为跨膜异二聚体，胞外 N 端结构域能够结合抗原肽并呈递给 T 细胞。人源 MHC I 由跨膜 α 链（由 HLA-A、HLA-B、HLA-C 编码）与小分子胞外蛋白 β₂微球蛋白组成；MHC II 为 α、β 亚基构成的异二聚体，两条链均包含跨膜区，分别由 HLA-DRA、DRB1、DRB3/4/5、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1 基因编码。人 HLA 基因集中分布于 6 号染色体 6p21.3 区段高度密集、结构复杂的 MHC 区域（Abualrous et al., 2021; Wieczorek et al., 2017）。MHC 基因丰富的多态性赋予免疫系统识别、应答多种病原体的能力。
MHC II 等位基因与炎症性疾病、过敏及自身免疫病等多种免疫疾病易感高度相关，特定等位基因会提升患病遗传风险（Lawson et al., 2025; Hakonarson & Grant, 2009）。本研究选取多个代表性 MHC II 等位基因开展表达评估，并重点分析全球人群高频等位基因 HLA-DRA01:01/DRB1 01:01（数据来源：allelefrequencies.net数据库）。
重组 MHC 蛋白具备广泛生物医学用途，包括 MHC - 多肽相互作用解析（Sidney et al., 2013）、实体器官移植抗 HLA 抗体检测（Bontadini, 2012）、抗原特异性 T 细胞鉴定（Galperin et al., 1996; Hansen et al., 2010; Mallajosyula et al., 2021; Cameron et al., 2002）。MHC I 可在大肠杆菌中较容易实现表达，但 MHC II 在大肠杆菌体系中极易发生错误折叠，制备难度大。HEK293 等哺乳动物细胞表达系统能够实现蛋白正确折叠与组装，但成本高昂，且存在人源病原体污染风险（Schütz et al., 2023; Serra et al., 2019; Willis et al., 2021）。植物表达系统用于 MHC II 制备的研究仍十分匮乏，据我们所知，目前尚无利用植物表达 MHC II 蛋白的报道。
本氏烟草与烟草亲缘关系相近，已成为成熟的植物生物合成平台。2014 年埃博拉疫情中，基于本氏烟草开发的 ZMapp 单抗鸡尾酒疗法得到应用（Capell et al., 2020; Ward et al., 2021）；新冠疫情期间，该体系也被快速用于病毒样颗粒疫苗与诊断试剂的生产（Capell et al., 2020; Ward et al., 2021）。筑波系统（Tsukuba system）依托优化病毒载体，可在本氏烟草中高效瞬时表达复杂蛋白，进一步拓展了该宿主在重组蛋白制备中的应用（Miura et al., 2020, 2023; Yamada et al., 2020）。为优化植物重组蛋白生产，可通过各类靶向信号与融合模块调控蛋白定位与稳定性。来源于本氏烟草的伸展蛋白分泌信号肽 SSExt 能够有效引导新生蛋白进入分泌通路（Jiang et al., 2020）；而 C 端 (SP) 10 糖基模块由 10 个丝氨酸 - 脯氨酸重复序列构成，作为促分泌融合标签，可显著提升重组蛋白可溶性，并促进蛋白在质外体积累（Jiang et al., 2020）。也有文献报道，(SP) 10 标签可延长烟草 BY-2 细胞表达重组人生长激素的体内血清半衰期（Xu et al., 2010）。针对结构复杂蛋白，C 端内质网滞留信号 SEKDEL 可将蛋白截留富集于内质网，内质网稳定微环境有利于蛋白正确折叠与组装（Hanittinan et al., 2022）。
本研究利用本氏烟草表达体系，成功表达 3 种不同亚型、多肽共价连接的 MHC II 分子；选取结合 CLIP 肽的 HLA-DRA01:01/DRB1 01:01（DR#1）与流感来源 HA 肽（306--318）的复合体（DR#2）作为代表，完成纯化、修饰与功能验证。基于 DR#2 的 Biacore 实验证实：植物表达的 pMHC II 可被同源 T 细胞受体 HA1.7 TCR 识别（该 TCR 同样可在植物中表达；Hennecke & Wiley, 2002）。上述结果表明，本氏烟草具备生产功能性 MHC II 蛋白的潜力。
2 结果
2.1 多种 pMHC II 蛋白可在本氏烟草中瞬时表达
为评估本氏烟草表达多种 pMHC II 可溶性胞外结构域的能力，本研究构建 3 种亚型（HLA-DR、DQ、DP）共 13 种 pMHC II 表达载体。每种 pMHC II 的 α 链、β 链分别设计为独立开放阅读框（ORF），单独克隆至 pTKB3 载体；载体搭载 N 端 SSExt 分泌信号肽与 C 端内质网滞留信号 KD（SEKDEL）（图 1B--D）。各元件排布方式如图 1A 所示；表 1 汇总所有 pMHC II 蛋白编号、目标等位基因及其结合多肽。HLA-DRA 序列高度保守，几乎无多态性；MHC II 分子多态性主要由 β 链基因决定。因此本实验采用同一 α 链，搭配携带不同抗原表位肽的多种 β 链开展表达分析。
多肽 - MHC II（pMHC II）载体构建设计与表达分析 (A) DRα 链与 DRβ 链载体元件排布设计。DRα 链载体包含 DRA01:01 等位基因可溶性胞外结构域（SED）、酸性拉链结构域（AZ）以及用于金属亲和纯化的 10×His 标签。DRβ 链载体 N 端融合抗原多肽，其后连接 DRB1 01:01 等位基因可溶性胞外结构域（SED）、碱性拉链结构域（BZ），C 端携带用于生物素标记的 Avi 标签。Factor Xa、TEV、凝血酶（Thrombin）与 HRV3C 分别代表不同蛋白酶特异性酶切位点。 (B--D) MHC II 表达质粒 pTKB3-ssExt-DRα-KD、pTKB3-ssExt-DRβ-KD 的 T-DNA 区域示意图。35S-p ×2：携带双增强子元件的花椰菜花叶病毒 35S 启动子；TMVΩ：烟草花叶病毒 5′前导序列（Ω 序列）；SSExt：本氏烟草伸展蛋白分泌信号肽；KD：SEKDEL 内质网滞留信号；HSPter：热激蛋白基因终止子；Ext3′：烟草伸展蛋白基因 3′调控元件；LIR、SIR：菜豆黄矮病毒（BeYDV）基因组长基因间区、短基因间区；C1/C2：菜豆黄矮病毒开放阅读框 C1、C2，分别编码复制起始蛋白 Rep 与 RepA；LB、RB：T-DNA 左边界、右边界；Nos-p、Nos-t：NOS 启动子与 NOS 终止子；p19：番茄丛矮病毒来源的基因沉默抑制子。 (E) 蛋白免疫印迹结果，利用本氏烟草叶片粗提物检测 DRA01:01（DRA）、携带 CLIP 肽的 DRB1 01:01（DRB1）、携带 HA 306--318 多肽的 DRB101:01（DRB2）的蛋白表达水平。 (F) 蛋白免疫印迹结果，利用本氏烟草叶片粗提物检测 DQA 01:02（DQA）、携带 CLIP 肽的 DQB106:02（DQB1）、携带 Hyp (1--10) 多肽的 DQB1 06:02（DQB2）的蛋白表达水平。 (G) 蛋白免疫印迹结果，利用本氏烟草叶片粗提物检测 DPA02:01（DPA）、携带 CLIP 肽的 DPB1 01:01（DPB1）、携带 HA 306--318 多肽的 DPB1*01:01（DPB2）的蛋白表达水平。图中标号泳道代表独立侵染的植株样本。
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| pMHC II ID | Alpha chain | Beta chain | DRB ID | Antigen source | Epitope sequence |
| DR#1 | DRA*01:01 | DRB1*01:01-CLIP | DRB#1 | Human | PVSKMRMATPLLMQA |
| DR#2 | DRA*01:01 | DRB1*01:01-HA1 (306--318) | DRB#2 | Influenza | PKYVKQNTLKLAT |
| DR#3 | DRA*01:01 | DRB1*01:01-EBNA (515--527) | DRB#3 | Epstein--Barr Virus | TSLYNLRRGTALA |
| DR#4 | DRA*01:01 | DRB1*15:01-CLIP | DRB#4 | Human | PVSKMRMATPLLMQA |
| DR#5 | DRA*01:01 | DRB1*15:01-Spike (236--250) | DRB#5 | SARS-CoV-2 virus | TRFQTLLALHRSYLT |
| DR#6 | DRA*01:01 | DRB1*15:01-Der P1 (96--110) | DRB#6 | Dermatophagoides pteronyssinus | LRQMRTVTPIRMQGG |
| DR#7 | DRA*01:01 | DRB1*15:01-Der P1 (251--265) | DRB#7 | Dermatophagoides pteronyssinus | AVNIVGYSNAQGVDY |
| DR#8 | DRA*01:01 | DRB1*04:01-CLIP | DRB#8 | Human | PVSKMRMATPLLMQA |
| DR#9 | DRA*01:01 | DRB1*04:01-HA1 (306--318) | DRB#9 | Influenza | PKYVKQNTLKLAT |
| DQ#1 | DQA1*01:02 | DQB1*06:02-CLIP | DQB#1 | Human | PVSKMRMATPLLMQA |
| DQ#2 | DQA1*01:02 | DQB1*06:02-Hyp (1--10) | DQB#2 | Human | PSTKVSWAAV |
| DP#1 | DPA1*02:01 | DPB1*01:01-CLIP | DPB#1 | Human | PVSKMRMATPLLMQA |
| DP#2 | DPA1*02:01 | DPB1*01:01-HA1 (306--318) | DPB#2 | Influenza | PKYVKQNTLKLAT |
蛋白免疫印迹证实，HLA-DRA01:01 可与多种 DRB 等位基因产物实现共表达，绝大多数载体构建体均可检测到清晰蛋白条带（图 1E、附图 S1）。仅有 DRB#3 与 DRB#4 表达载体蛋白水平偏低；二者分别编码融合 EB 病毒核抗原 1 肽段 EBNA (515--527) 的 DRB1 01:01、以及融合 CLIP 肽的 DRB115:01（附图 S1）。随后本研究对 HLA-DQ（DQA1 01:02/DQB106:02）开展表达检测，该基因型与 1 型发作性睡病高度关联（Mignot et al., 2001），且已有晶体结构报道（Siebold et al., 2004）。分别呈递 CLIP 肽（DQ#1）与食欲素肽 N 端 13 个氨基酸（DQ#2）的 DQB1 载体均可成功表达（图 1F）。与之类似，分别呈递 CLIP 肽（DP#1）和 HA (306--318) 肽（DP#2）的 HLA-DP（DPA1 02:01/DPB1*01:01）也获得高效表达（图 1G）。本研究参照已有报道的策略，将抗原肽与 MHC II 分子进行共价连接（Kozono et al., 1994）。值得注意的是，多种 MHC II 蛋白的表达分析仅为定性检测，旨在评估本氏烟草作为该类蛋白生产平台的可行性。为定量测定 DR#1 与 DR#2 的产量，利用已知浓度多标签蛋白作为参照，对表达 DR#1、DR#2 的本氏烟草叶片可溶性粗蛋白进行蛋白免疫印迹定量（附图 S2）。根据条带灰度估算，DR#1 中 DRA、DR#2 中 DRA 平均表达量分别为 53 μg/g 鲜重、60 μg/g 鲜重。
2.2 利用金属亲和层析初步纯化植物源 pMHC II 蛋白
后续功能实验选取 DR#1、DR#2 作为研究模型。首先采用 30% 硫酸铵分级沉淀对粗提物进行初步富集，去除大量宿主内源蛋白，同时分析 pMHC II 在可溶性组分与沉淀组分中的分布。两组分免疫印迹结果显示，绝大多数 pMHC II 分布于可溶性上清中（图 2A）。定量结果表明，上清中包含约 74% 的 DRA、89% 的 DRB#1 以及 85% 的 DRB#2（图 2A）。 本研究采用两步法纯化 pMHC II 复合物：收集可溶性组分并置换缓冲液，适配钴离子 TALON 金属亲和层析结合缓冲液。钴介质结合容量虽低于镍离子填料，但特异性更强，可减少植物大量内源蛋白（如核酮糖 - 1,5 - 二磷酸羧化酶 / 加氧酶 RuBisCO）的非特异性吸附，提升纯化纯度，满足后续实验需求。DRA 与 DRB 蛋白均可有效洗脱并在洗脱组分中检出，但仍有部分蛋白存在于流穿液（图 2B）。在结合 His 标签 DRA 蛋白的洗脱组分中检测到 DRB，证明在本氏烟草细胞内 α 链与 β 链能够形成异二聚体（图 2B）。 为验证 DQ、DP 型 MHC II 分子 α/β 链的异二聚化，我们同样开展金属亲和层析实验，结果在 DQ（附图 S3A）与 DP（附图 S3B）纯化洗脱组分中均可同时检出两条链。上述结果进一步证明：借助带有内质网滞留信号、亮氨酸拉链结构域的筑波系统载体，在本氏烟草中表达的多种 MHC II 蛋白能够成功组装形成异二聚体。
pMHC II 的组分分离分析、体外生物素标记与纯化 (A) 30% 硫酸铵分级沉淀去除高丰度宿主蛋白；上清组分 (S) 与沉淀组分 (P) 样品用于蛋白免疫印迹分析。 (B) 采用 TALON 填料对 pMHC II 蛋白进行金属亲和层析。W：上柱前总蛋白提取物；Ft：流穿液；F1--F5：1～5 号洗脱组分。 (C) 利用 DR#1 与商品化 GST-BirA 开展小规模体外生物素标记预实验。 (D) 蛋白免疫印迹结果，展示大规模体外生物素标记实验；分别检测添加 / 不添加商品化 GST-BirA 条件下 DR#1 与 DR#2 的标记效果。 (E)(F) 使用 AKTA start 系统进行离子交换层析 (IEX) 得到的洗脱图谱；分别对应 DR#1（DRA01:01 / 携带 CLIP 肽的 DRB1 01:01）、DR#2（DRA01:01 / 携带 HA 306--318 肽的 DRB1 01:01），依据对应洗脱峰收集组分并进行免疫印迹验证。
2.3 利用 BirA 酶对植物源 MHC II 蛋白进行生物素标记
重组 MHC II 最重要的用途之一是鉴定抗原特异性 T 细胞受体（TCR）。单体 MHC II 与 TCR 之间平衡解离常数（KD）偏弱，约 1~200 μM，难以直接检测二者相互作用（Mallajosyula et al., 2021）。因此需要制备多价 MHC II 复合物（四聚体、葡聚糖多聚体等）实现 TCR 高效检测。绝大多数多聚体制备策略依赖 MHC II 生物素标记，再与荧光标记链霉亲和素偶联。 本研究使用商品化生物素连接酶 GST-BirA，探究 MHC II 体外生物素标记方案。首先使用纯化 DR#1 蛋白，在 GST-BirA 与生物素共存条件下开展小规模标记预实验。利用抗生物素抗体进行免疫印迹检测，仅在同时加入 GST-BirA 与生物素的反应体系中，DR#1 的 β 链出现清晰条带，证明生物素成功整合至带有 Avi 标签的 pMHC II 蛋白（图 2C）；反应体系中还可检测到少量残留 GST-BirA 产生的微弱信号。后续大规模标记实验同样在 DRB 蛋白位置检测到特异性抗生物素信号，证实植物表达 pMHC II 可体外生物素化，适用于后续多聚体制备（图 2D）。
2.4 离子交换层析对 MHC II 蛋白二次纯化
收集亲和层析洗脱组分，更换缓冲液为 MES 缓冲液（pH 6.5；pMHC II 等电点约 pH 5.5），开展阴离子交换层析（AEX）。层析结果显示，DR#1 目标峰出现在 7--13 组分，DR#2 目标峰位于 8--16 组分；免疫印迹证实该洗脱峰对应目标 pMHC II 蛋白（图 2E、F）。
2.5 纯化后 pMHC II 定量（用于后续功能实验）
以 BSA 制作标准曲线，通过 SDS-PAGE 条带灰度定量分析（图 3A、B），纯化所得 DR#1、DR#2 平均产量分别为 4.37 μg/g 鲜重、2.81 μg/g 鲜重。该数值为蛋白经过亲和层析、离子交换层析与浓缩步骤后的最终回收率，代表最终可获得的目标蛋白产量。
本氏烟草表达 pMHC II 蛋白的定量分析 (A) 考马斯亮蓝染色凝胶图；两组重复浓缩样品分别为结合 CLIP 肽的 HLA-DRB101:01、结合 HA 306--318 肽的 HLA-DRB1 01:01，并设置一系列浓度 BSA 作为参照。Conc.1、Conc.2 代表两次独立实验获得的浓缩洗脱组分。 (B) 基于不同浓度 BSA 及其 ImageJ 定量条带灰度值构建标准曲线；线性趋势方程与决定系数\(R^2\)由 Excel 计算得到，用于测算 HLA 蛋白浓度。
2.6 本氏烟草表达 pMHC II 蛋白的天然构象及功能性识别
前述蛋白免疫印迹与考马斯亮蓝染色实验均在蛋白变性条件下开展分析。为验证植物源 pMHC II 能否维持抗原可结合位点与完整空间结构，本研究收集 DR#1、DR#2 浓缩样品，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）进行检测。一抗选用抗人 HLA-DP/DQ/DR β 链单克隆抗体 WR18（伯乐公司）；二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG（Santa Cruz）。 人 MHC 蛋白又称人白细胞抗原（HLA），可被抗 HLA 抗体识别，借此实现 MHC II β 链检测。相较于阴性对照，DR#1 与 DR#2 均呈现显著增强的信号，与表达 DRB109:01 或 DRB1 04:05 的 NIH3T3 细胞裂解液趋势一致；DR#1、DR#2 信号强度与阳性对照组水平相当（图 4A、B）。上述结果证明，植物制备的 pMHC II 蛋白在天然条件下具备可被检测的 HLA-DR β 链抗原表位。
pMHC II 蛋白完整构象评估
(A) ELISA 酶标板成像：ECL 底物孵育 60 s 后采集化学发光信号强度。 (B) 450 nm 波长下各样品发光信号定量柱状图。DR1-1、DR1-2：携带 CLIP 肽的 HLA-DRB101:01 两组生物学重复；DR2-1、DR2-2：携带 HA 306--318 肽的 HLA-DRB1 01:01 两组生物学重复。阴性对照（-）Ctrl（mock）：小鼠 NIH3T3 细胞裂解液；阳性对照 (+) DR0901、(+) DR0405：分别表达 HLA-DRB109:01、HLA-DRB1 04:05 的 NIH3T3 细胞裂解液。 (C、D) 用于表达 HA1.7 TCR 的载体 pTKB3-ssExt-HA1.7TCRα-KD/(SP) 10、pTKB3-ssExt-HA1.7TCRβ-KD/(SP) 10 的 T-DNA 区域示意图；KD 代表 SEKDEL 内质网滞留信号。 (E、F) 本氏烟草叶片粗提物 HA1.7 TCRα、HA1.7 TCRβ 蛋白免疫印迹检测结果；数字泳道代表独立农杆菌浸润植株。 (G、J) Biacore 互作分析：分别以糖基化、去糖基化 HA1.7 TCR 为固定配体，流动相为结合 CLIP 肽或 HA 抗原肽的 DR*01:01。 (H) HA1.7 TCRα 经 PNGase F 酶切 16 h、24 h 后的蛋白免疫印迹结果。 (I) Pro-Q Emerald 300 糖蛋白染色凝胶荧光图，显示 PNGase F 处理后的 HA1.7 TCRα 糖信号。
由于 pMHC II 与 TCR 天然亲和力较弱，结合动力学速率快，本研究采用表面等离子体共振技术（Biacore）探究植物源 DR#2（呈递 HA 306--318）与其同源 TCR（HA1.7）的相互作用（Hennecke & Wiley, 2002）。为制备 TCR，对 HA1.7 TCR α、β 链进行密码子优化，载体引入拉链结构域促进异二聚体组装，并添加 AGIA 标签用于 Biacore 芯片捕获（图 4C、D）。本研究测试两种 C 端元件：内质网滞留信号序列、(SP) 10 糖基模块。仅搭载 (SP) 10 序列时，α、β 链均可成功表达；搭载内质网滞留信号时仅能检测到 β 链（图 4E、F）。值得注意的是，(SP) 10 介导表达的 α 链出现多条分子量相差 3--4 kDa 的条带，符合蛋白糖基化特征（图 4E）。
NetNGlyc 1.0 预测 HA1.7 TCRβ 链存在 3 个潜在 N - 糖基化位点：Asn-24、Asn-148、Asn-182，预测得分分别为 0.79、0.60、0.50（附图 S4A）。Asn-24 位点靠近 pMHC II 结合界面（附图 S4B），可能对二者互作至关重要。为探究糖基化的功能效应，将 (SP) 10 模块表达获得的 HA1.7 TCR α/β 异二聚体用于 Biacore 实验。结果显示，呈递 HA 306--318 肽的 DR#2 可特异性结合 HA1.7 TCR，利用 GraphPad PRISM 拟合得到平衡解离常数KD=3.62±1.59 μM 。
为验证糖基化修饰，纯化 HA1.7 TCR 经 PNGase F 处理后采用 Pro-Q Emerald 300 糖蛋白染色。样品可观测到清晰糖链荧光信号，延长 PNGase F 酶切时间后信号减弱（图 4I）。相较于未处理样品，去糖基化后 β 链分子量偏移消失（图 4H）。最后，对去糖基化 HA1.7 TCR 开展 Biacore 检测，结果显示其与 DR#2 的相互作用完全消失（图 4J）。
3 讨论
本研究成功建立本氏烟草表达平台，用于制备重组人 MHC II 类蛋白与 TCR。依托筑库瞬时表达系统，实现 HLA-DR、DQ、DP 代表性 MHC II 亚型的表达（图 1E--G、附图 S1）；并建立两步层析纯化策略：先亲和层析，再离子交换层析。功能实验证实，部分纯化蛋白保留完整空间构象，可在 Biacore 实验中依靠糖基化修饰实现与同源 TCR 特异性结合。据我们所知，本研究首次报道利用植物系统制备具备同源 TCR 结合活性的重组人 MHC II 蛋白。
可溶性 MHC II 重组表达存在显著技术难点：蛋白正确组装需要 α、β 链协同折叠、抗原肽有效装载，且依赖糖基化维持构象稳定。此外，可溶性 MHC II 复合物构象稳定性差，极易发生聚集，异源表达体系中该问题尤为突出（Cameron et al., 2002）。本研究通过 His 标签 α 链亲和共纯化，可同时检出 DR、DQ、DP 多种 MHC II 的 β 链，证明植物体系内能够形成异二聚体。尽管 α、β 链共纯化证实异二聚体组装，但本研究未准确定量完全组装复合体的比例与化学计量比。
粗提可溶性蛋白中，DR#1、DR#2 的 DRA 表达量估算分别为 53 μg/g 鲜重、60 μg/g 鲜重（附图 S2）。经过纯化后，DR#1 终产量 4.37 μg/g 鲜重，DR#2 为 2.81 μg/g 鲜重。传统可溶性 MHC 蛋白生产体系包括大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞。大肠杆菌体系常面临蛋白错误折叠、聚集问题，复性流程繁琐，产物得率低、均一性差（Saikia et al., 2026）。HEK293、昆虫细胞等哺乳动物表达系统折叠与组装效果更佳，广泛用于蛋白结构解析，同时商业化生产 MHC II 单体与多聚体（Tatsis et al., 2004）。文献报道大肠杆菌与昆虫细胞纯化后 DR - 肽复合物产量约 0.1 mg/L（Cameron et al., 2002）。若近似按 1 g ≈ 1 mL 换算，本植物体系产量高于大肠杆菌与昆虫细胞。果蝇 S2 细胞经过工艺优化后性能提升，稳定表达 MHC II 孵育 5 d 体积产率可达 50 mg/L（Shen et al., 2018）；本氏烟草粗提物产量与优化后的 S2 细胞水平接近。但细胞培养体系成本高、操作门槛高，同时存在人源病原污染生物安全风险。与之相比，本研究建立的本氏烟草平台具备多重优势：易于规模化生产、基础设施投入低、生物安全风险小（Zahmanova et al., 2023）、瞬时表达速度快，可短时间平行构建多种 MHC 蛋白。该优势对于 MHC 蛋白研究尤为重要：HLA 是人类多态性最高的基因座之一，免疫学研究与个体化医疗需要快速获得大量等位基因对应的蛋白。
本研究中植物源 MHC II 积累量（约 50 μg/g 鲜重）低于植物瞬时表达重组抗体等多聚糖蛋白（抗体最高可达 300 μg/g 鲜重）（Miura et al., 2020）。该差异源于 MHC II 分子更高的结构复杂度：其正确折叠与积累需要 α/β 链协同组装、二硫键形成，同时依靠结合多肽维持构象稳定。后续可通过载体改造、胞内靶向信号优化进一步提升蛋白积累量。
成本优势是植物表达体系核心亮点。例如 Immudex 商业化 HLA-DRB1*01:01 pMHC 单体售价约 4360 欧元 / 100 μg。本研究纯化浓缩后 DR#1 产量 4.37 μg/g 鲜重、DR#2 产量 2.81 μg/g 鲜重，理论上利用适度规模植物材料即可获得毫克级重组 MHC II 蛋白。由于缺少大规模生产线，难以精确核算成本，本文参照已有研究开展估算（Walwyn et al., 2015）。文献报道辣根过氧化物酶（HRP）生物量表达量 240 mg/kg，纯化回收率 54%，纯化后产量 130 mg/kg 生物量，对应的生产成本约 1279 美元 /g。相比之下，本研究 MHC 单体纯化产量约 3--4 μg/g 鲜重（3--4 mg/kg 鲜重）。通常下游纯化成本远高于上游培养成本（Ma et al., 2005）；假设纯化条件一致，单位产物生产成本与产量近似成反比，推算 MHC II 生产成本约 40000--50000 美元 /g（40--50 美元 /μg）。 需要说明：多步纯化造成大量蛋白损失，终回收率显著低于粗提物表达水平，该数值同时反映表达效率与下游回收效率。本研究选用钴离子 TALON 亲和填料优先保证结合特异性，牺牲部分结合容量，不可避免造成蛋白损失，这也是粗提产量与最终纯化产量存在差距的重要原因。兼具低成本、可瞬时并行表达大量 MHC 等位蛋白的优势，植物体系具备应用潜力：用于抗原特异性 T 细胞鉴定、移植医学抗 HLA 抗体检测抗原、MHC 结构与多肽结合谱研究。
植物源重组蛋白需要关注植物特有 N - 糖链结构，关系生物医药应用可行性（Castiho and Steinkellner, 2012）。植物糖链主要差异在于末端 β1,2 - 木糖与 α1,3 - 岩藻糖修饰，可能改变蛋白免疫原性或受体识别能力（Strasser, 2016）。尽管存在上述顾虑，本 Biacore 结果证实植物表达 pMHC II 能够与糖基化同源 TCR 有效结合（图 4G），说明植物型糖基化修饰不会完全阻断受体相互作用。有趣的是，PNGase F 切除 HA1.7 TCR 糖链后，其与 DR#2 的结合完全消失，提示糖基化参与维持受体配体亲和力或蛋白构象稳定（图 4J）。 需要说明：PNGase F 仅能证实 N - 糖链存在，无法区分糖链精细结构与成熟状态；同时该酶难以切除带有植物特有 α1,3 - 岩藻糖修饰的 N - 糖链，如需精细解析可采用 PNGase A 或糖组学分析（Jiang et al., 2020）。本实验测得结合常数 KD=3.62±1.59 μM，落在已报道 TCR-MHC 互作典型区间（1--100 μM），该类相互作用普遍为微摩尔级弱亲和力（Alam et al., 1996; van der Merwe and Davis, 2003; Cole et al., 2007）。Cole 等人（2007）报道 HA1.7 TCR 与两种呈递 HA 抗原的 MHC II 等位基因结合 KD 为 37--40 μM。后续还需探究不同靶向信号介导产生的差异化糖基化谱如何影响重组 TCR、MHC II 的结构与功能。本研究未直接对植物源 MHC II 开展糖链图谱分析，重组蛋白精确糖基化组成与异质性尚不明确。后续可借助质谱糖组学、糖工程改造植株，深入解析糖基化对蛋白折叠、受体互作及生物医药应用的影响。ΔXT/FT 等糖工程本氏烟草缺失植物特有糖残基，可产生与人源糖型更加接近的重组蛋白，是后续极具价值的研究材料（Jansing et al., 2018）。
为实现高效重组表达，MHC II 载体采用伸展蛋白信号肽 SSExt 搭配内质网滞留信号。所有测试载体均可检测到目标蛋白积累（图 1E--G、附图 S1），证明该策略适用于植物中重组 MHC II 生产。内质网滞留信号能够减少高尔基体介导的植物成熟糖链生成，富集高甘露糖型糖蛋白；相较于完全成熟的植物糖链，高甘露糖糖蛋白免疫原性更低（He et al., 2012）。虽然 α、β 链共纯化以及 TCR 结合实验证明功能性 pMHC II 复合体形成，但仍需定量正确折叠活性分子比例、组装异二聚体的化学计量比，进一步拓展植物源 MHC II 在生物医药与免疫治疗领域的应用。
与 MHC II 载体不同，仅同时搭载 SSExt 分泌信号与 (SP) 10 糖基模块时，HA1.7 TCR α、β 链才能实现高表达；使用内质网滞留信号的载体几乎检测不到目标蛋白（图 4E、F）。本研究未通过质外体洗涤液直接验证蛋白分泌情况，但 PNGase F 酶切后高分子量条带消失（图 4E,H,I），说明重组 TCR 发生广泛 N - 糖基化，蛋白经过分泌途径转运并在质外体完成糖链成熟。已有文献报道 SSExt-(SP) 10 组合策略可提升植物蛋白分泌效率，促进广泛 N 糖基化，且蛋白在哺乳动物细胞功能实验中具备生物活性（Jiang et al., 2020; Xu et al., 2010）。
综上，分泌靶向信号与糖基化模式显著影响植物免疫重组蛋白的积累量与功能特性。后续优化转运信号、分泌通路，结合糖工程技术有望进一步提升 pMHC II 产量与生物活性。
本研究在 MHC II β 链引入 Avi 标签，可通过 BirA 酶体外生物素标记，满足后续多聚体制备需求。小规模与大规模标记实验的抗生物素免疫印迹均证实生物素成功偶联至重组 MHC II（图 2C、D）。但本研究未定量标记效率与产物均一性。高效生物素化至关重要：单体 MHC-TCR 相互作用偏弱，通常需要与荧光链霉亲和素或多价支架（Immudex Klickmer、铁蛋白多聚体等）组装成多聚体，才能灵敏检测抗原特异性 T 细胞（Mallajosyula et al., 2021）。因此后续需要优化生物素标记条件、完善多聚体组装方案，开发适用于流式细胞分选（FACS）、免疫监测、抗原特异性 T 细胞鉴定的 pMHC II 四聚体 / 葡聚糖多聚体试剂。
总而言之，本研究证实本氏烟草有潜力作为人 MHC II 蛋白生产平台。植物制备的 pMHC II 具备受体结合能力，保留足够空间构象实现同源 TCR 相互作用；说明植物型糖基化不会阻断受体识别，在特定条件下还能够支撑蛋白相互作用。该研究为利用植物体系制备 MHC II、TCR 等复杂免疫重组蛋白奠定基础，有望广泛服务基础免疫学与临床医学研究。
4 实验方法
4.1 植物材料与培养条件
将本氏烟草种子播种于疏松岩棉基质。幼苗置于植物培养箱中培养，培养温度 23 ℃，光周期 16 h 光照 / 8 h 黑暗，白光光照强度 100 μmol・m⁻²・s⁻¹（Saur et al., 2016；Yang et al., 2023）。选用 5～6 周龄植株进行农杆菌浸润实验。
4.2 载体构建设计
MHC II 载体构建参照可溶性 MHC II 分子表达的已有方案并加以改造（Dileepan et al., 2021；Henderson et al., 2007），α 链、携带不同抗原肽的多种 β 等位基因载体设计如图 1A--D、表 1 所示。载体表达成熟胞外区序列；α、β 链胞外区通过烟草蚀纹病毒（TEV）酶切位点（LEGGSGENLYFQGGSG）连接一对亮氨酸拉链结构域。酸性拉链序列：TTAPSAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQ；碱性拉链序列：TTAPSAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQ（Cheng et al., 1994）。亮氨酸拉链能够促进 α、β 链形成二聚体，并提升蛋白稳定性（Landschulz et al., 1988；O'Shea et al., 1991；Vinson et al., 2002）。 此外，β 链载体引入 BirA 生物素连接酶识别位点（GGSGGLNDIFEAQKIEWHE），用于生物素标记，满足后续四聚体 / 多聚体制备需求。α 链载体融合 10×His 标签，便于 TALON 填料亲和纯化。
HA1.7 TCR 载体构建参照已有文献（Hennecke et al., 2000），设计方案见图 4C、D。α 链框架与上述 MHC α 链一致；用于质外体分泌的载体，在 His 标签上游插入 (SP) 10 序列。β 链构建策略相近，C 端额外添加 AGIA 标签（Fairhead and Howarth, 2015），用于 Biacore 芯片捕获。
4.3 PCR 扩增与载体克隆
依据本氏烟草密码子偏好性对目标 DNA 序列进行密码子优化，由 Integrated DNA Technologies（IDT）公司合成；利用表 S1 所列引物扩增目的片段，通过 In-Fusion HD 无缝克隆试剂盒（Takara Bio）连接至 SalI 酶切后的 pTKB3 载体（Nosaki et al., 2021）。 载体自带本氏烟草来源伸展蛋白 N 端分泌信号肽 SSExt，提升蛋白可溶性与表达量（Jiang et al., 2020）；C 端携带内质网滞留信号，将蛋白滞留于内质网内（Zagouras and Rose, 1989）。携带 (SP) 10 序列的载体基于去除内质网滞留信号的 pTKB3 骨架构建。 所有重组载体通过电转化导入根癌农杆菌 GV3101 菌株，用于后续植物浸润。
4.4 本氏烟草蛋白瞬时表达
农杆菌菌液制备与本氏烟草瞬时表达参照已有方法（Yamamoto et al., 2018）并适当调整。携带二元载体的农杆菌 GV3101 接种于添加抗生素的 L-broth 培养基（卡那霉素 100 mg/L、庆大霉素 30 mg/L、利福平 30 mg/L），28 ℃培养 2 d。 将 2 d 菌液按 1:100 稀释至含相同抗生素、10 mM MES（pH 5.6）与 20 μM 乙酰丁香酮的新鲜培养基，28 ℃摇床 140 rpm 继续培养 18--24 h。离心收集菌体，重悬于浸润缓冲液（10 mM MgCl₂、10 mM MES pH 5.6、100 μM 乙酰丁香酮），调节 OD₆₀₀≈1。 分别携带 α 链载体、β 链载体的农杆菌菌液调至相同 OD 值后等体积混合，用于浸润。选取本氏烟草叶片浸没菌液，真空浸润 29 inHg，处理 2 min（Yamada et al., 2020）。浸润完成后叶面喷施 200 mM 抗坏血酸钠抑制叶片坏死（Nosaki et al., 2021）；植株置于 25 ℃、16 h 光照 / 8 h 黑暗条件培养 3 d。
4.5 蛋白提取与 TALON 金属亲和层析纯化
可溶性蛋白提取参照文献（Miura et al., 2012）并优化。取 100 g 植物叶片液氮冷冻，使用 Vitamix E310 破壁机粉碎；按照料液比 1:5 加入裂解缓冲液【50 mM Tris--HCl（pH 8.0）、120 mM NaCl、0.2 mM 原钒酸钠、100 mM NaF、10% 甘油、0.2% Triton X-100、5 mM DTT、1× 蛋白酶抑制剂混合液（Nacalai Tesque）】重悬。 注：原钒酸钠与氟化钠并非 pMHC II 表达与稳定必需，仅作为通用磷酸酶抑制剂添加。样品冰上振荡孵育 1 h，Miracloth 滤布过滤；44000×g、4 ℃离心 20 min。上清加入硫酸铵至终饱和度 30%，冰上振荡 1 h 后再次离心。 收集上清，截留分子量 3500 透析袋透析除去硫酸铵与裂解液，置换为结合缓冲液（10 mM Tris pH7.4、0.5 M NaCl、20 mM 咪唑、1 mM PMSF）。 利用 10 mL 钴填料 TALON 悬液（填料床体积 5 mL，Takara）纯化带有 10×His 标签的 α 链融合蛋白。样品上样后，5 倍柱体积结合缓冲液洗涤 3 次去除非特异性结合蛋白；洗脱缓冲液（10 mM Tris pH7.4、0.5 M NaCl、500 mM 咪唑、1 mM PMSF）分 5 份洗脱，每份体积等于填料床体积。 同一蛋白重复纯化时，TALON 填料再生流程：5 倍柱体积 20 mM MES（pH5.0，含 0.1 M NaCl）洗涤 → 5 倍柱体积纯水冲洗；4 ℃保存于 20% 乙醇（含 0.1% 叠氮化钠）。
4.6 MHC II 单体体外生物素标记
TALON 亲和层析洗脱组分（约 50 mL）使用截留分子量 30 kDa 超滤管（Sartorius Vivaspin Turbo 15）浓缩至 10 mL，参照已有方案（Fairhead and Howarth, 2015）略作修改开展体外生物素标记。 先进行小规模预实验：50 μL 体系包含 GST-BirA（500 nM）、生物素（25 μM）、5 mM MgCl₂、1 mM ATP，37 ℃孵育 1 h。随后开展大规模标记：浓缩后的 pMHC II 蛋白配制成 10 mL 反应体系，组分与预实验一致；37 ℃孵育 3 h，之后进行离子交换层析纯化。采用抗生物素抗体免疫印迹定性验证生物素标记效率。
4.7 离子交换层析纯化
利用在线工具https://www.protpi.ch计算 pMHC II（HLA-DRA01:01 分别联合携带 CLIP 肽 DR#1、HA 抗原肽 DR#2 的 HLA-DRB1 01:01）等电点。大规模生物素标记反应液使用 3500 MWCO 透析袋置换缓冲液至 10 mM MES（pH 6.5）。 采用 AKTA start 蛋白纯化系统（Cytiva）搭配 HiTrap Q FF 阴离子交换柱进行离子交换层析。收集洗脱峰蛋白，30 kDa 超滤管浓缩并置换缓冲液至 pH7.0 PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、24.8 mM Tris）。
4.8 考马斯亮蓝染色与蛋白免疫印迹（WB）
蛋白样品处理参照 Ramadan 等人（2024）方法：10 μL 蛋白样品与 2.5 μL 5× 上样缓冲液混匀，95 ℃煮沸 5 min；SDS-PAGE 电泳后考马斯亮蓝（CBB）染色，ATTO WSE-6300 LuminoGraph III 成像。 以 BSA 梯度样品作为标准品，SDS-PAGE 条带灰度定量估算蛋白浓度；ImageJ 软件定量条带，基于 BSA 标准曲线计算 pMHC II 浓度。 免疫印迹流程：蛋白电泳后转印至 PVDF 膜（Amersham Hybond P）；一抗选用抗 6×His 标签抗体（ab9108, Abcam）、Avi 标签鼠单克隆抗体（Genscript）；二抗使用 HRP 标记兔抗鼠 IgG、HRP 标记抗生物素抗体（CST）。膜片使用 Luminata Forte 化学发光底物孵育，WSE-6300 系统采集信号。 蛋白定量实验：DR#1、DR#2 浓缩样品与 BSA 梯度同时进行 SDS-PAGE、CBB 染色；ImageJ 软件读取所有条带灰度。
4.9 酶联免疫吸附实验（ELISA）
将 PBS（pH7.0）中的 pMHC II 蛋白浓度调整至 DR#1≈1 μg/mL、DR#2≈0.7 μg/mL；各取 10 μL 加入镍修饰酶标板（Thermo Fisher），室温条件下于含 0.1%(v/v) Tween 20 的 PBS（PBS-T）孵育 2 h。 小鼠 NIH3T3 细胞裂解液作为阴性对照；稳定表达 DRA101:01-DRB1 09:01、DRA101:01-DRB1 04:05 的 NIH3T3 裂解液作为阳性对照。PBS-T 洗涤后加入 100 μL 鼠抗人 HLA-DP/DQ/DR β 单克隆抗体 WR18（BIO-RAD，1 μg/mL PBS 稀释），室温孵育 1 h；再次洗涤，加入 40 μL ECL Prime 发光试剂。 化学发光信号曝光 60 s，使用 Sayaca-Imager 与 Valioskan LUX 酶标仪采集数据。
4.10 Biacore 互作检测
参照 Mamedov 等人（2016）方法，使用 Biacore T100 仪器开展互作分析，采用捕获法实验方案。通过氨基偶联将 AGIA 抗体固定于 CM5 传感芯片两个通道，固定响应值约 5000--6000 RU。 将带有 AGIA 标签的 HA1.7 TCR 手动进样，流速 10 μL/min，多次循环进样 60 s，使捕获响应值达到 300 RU。运行缓冲液为含 0.05%(w/v) Tween 20 的 PBS（pH7.4）。 使用运行缓冲液配制梯度稀释的 DR#1、DR#2，流速 30 μL/min 进样检测分子相互作用。以仅固定 AGIA 抗体的通道信号作为空白扣除基线。利用 GraphPad PRISM 软件，采用单点结合模型拟合平衡结合数据，计算平衡解离常数\(K_D\)。
4.11 N - 糖基化预测、体外去糖基化与糖链检测
利用 NetNGlyc 1.0 在线服务器预测 HA1.7 TCRβ 潜在 N 糖基化位点（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）。该工具基于人工神经网络识别 Asn-Xaa-Ser/Thr 基序周边序列环境；预测得分＞0.5 判定为潜在糖基化位点（Gupta and Brunak, 2002）。 按照商品化试剂盒说明书，在非变性条件下使用 PNGase F（NEB）对纯化 HA1.7 TCRα 进行去糖基化。100 μL 反应体系包含 20 μg HA1.7 TCRα、GlycoBuffer 2、5 μL PNGase F（约 2500 U），分别孵育 16 h、24 h。 PNGase F 酶活定义：37 ℃条件下 10 μL 体系 1 h 去除＞95% 变性糖蛋白 N 糖链。天然构象糖蛋白糖链暴露程度更低，依据厂商推荐提高酶用量并延长孵育时间。 采用免疫印迹与 Pro-Q Emerald 300 糖蛋白染色试剂盒检测糖基化状态。染色实验：0.25 μg 蛋白上样，10% SDS-PAGE 分离，按照试剂盒说明书染色；ATTO WSE-6300 LuminoGraph III 采集荧光（激发滤光片 BP 300--320 nm，发射滤光片 BP 520--540 nm，绿色通道）。 从 RCSB 蛋白数据库获取 HA1.7 TCR 与携带流感 HA 肽的 DR MHC II 复合物晶体结构（PDB ID:1J8H），使用 RCSB PDB 在线 3D 可视化工具分析 TCR-pMHC II 结合界面，重点观察 Asn-24 预测糖基化位点空间位置。