Tandem duplication-driven expansion and UV-B stress adaptation of the LHC gene family in Artemisia annua L.
黄花蒿 LHC 基因家族的串联重复驱动扩张及其 UV-B 胁迫适应性
摘要
背景 ：黄花蒿（Artemisia annua L.）是抗疟药物青蒿素最主要的天然来源。在自然环境中，波动光是影响植物生长与青蒿素生物合成的重要环境胁迫。捕光叶绿素 a/b 结合蛋白（LHC）超家族在介导植物对波动光的响应过程中发挥关键作用，但目前尚未针对黄花蒿开展该基因家族的系统研究，制约了我们对这一药用植物光适应机制的理解。
结果 ：本研究解析了黄花蒿捕光叶绿素 a/b 结合蛋白（LHC）超家族的进化动态与功能适应性，重点关注早期光诱导蛋白（ELIP）亚家族。对 24 种植物的比较基因组分析表明，菊科进化分支中 LHC 超家族近期通过复制事件发生家族扩张。基于 4 套黄花蒿单倍型基因组共鉴定得到 229 个 LHC 基因，包含 205 个等位基因位点与 24 个单倍型特有序列位点；其中 ELIP 亚家族通过串联重复发生显著扩张。值得注意的是，与非菊科植物不同，菊科 ELIP 基因均呈现统一的单外显子结构，该基因组特征为菊科植物所特有。对 41 份黄花蒿个体的群体基因组分析显示，该基因位点存在拷贝数动态变异，拷贝数范围为 14 个。有趣的是，一个结构发生破坏的 ELIP 等位基因仍具备转录活性，可产生较长的异常转录本，说明该亚家族仍处于活跃进化状态。UVB 胁迫条件下，多个AaELIP 位点呈现同步诱导上调趋势，但表达丰度存在差异，提示扩张形成的串联基因簇内部发生功能分化，分为主效基因与辅助功能基因。总体而言，ELIP 对光胁迫的响应在进化上保守；而黄花蒿AaELIP 发生的大规模扩张与结构精简，是一项重要进化适应性特征，能够提升植物应对强光与辐射胁迫的能力。
结论 ：本研究证实黄花蒿 LHC 超家族发生显著扩张，尤以 ELIP 亚家族最为突出，且该亚家族对 UVB 处理存在强烈响应，表明 ELIP 在介导光胁迫应答中发挥核心作用。该研究结果为后续解析黄花蒿适应复杂光环境的分子机制提供重要研究基础。
关键词 ：黄花蒿；LHC；ELIP；UVB；动态进化
引言
黄花蒿是广泛分布于世界各地的传统药用植物，也是一线抗疟药物青蒿素的唯一天然来源 14。黄花蒿为典型阳生植物，在原生环境中经常面临复杂多变的强光照条件。强光会引发光抑制，使光合能力下降 14%，同时非光化学淬灭（NPQ）水平显著上调 5。光除了作为能量来源与发育信号 6，波动光照还会造成活性氧（ROS）积累，进而影响叶片青蒿素的含量 5,78。在多变光照环境下维持代谢产出需要完善的遗传基础，解析黄花蒿响应复杂光环境的分子机制，对阐明该药用物种的生态抗逆性与环境适应机理具有重要意义。
捕光叶绿素 a/b 结合蛋白（LHC）超家族成员是植物光保护与光适应过程的核心组分 9。该超家族在结构与功能上分为两类：一类是正常条件下负责捕获光能的经典天线蛋白；另一类是胁迫诱导型类 LHC 蛋白，主要功能是缓解光损伤 910。遭受环境胁迫时，多数类 LHC 蛋白，包括单螺旋蛋白（OHP）、胁迫增强蛋白（SEP）、类 LHC 蛋白（Lil）以及早期光诱导蛋白（ELIP）会特异性上调，通过 NPQ 等机制耗散过剩光能，避免活性氧大量生成 9,1112。其中 ELIP 是最早被发现的一类蛋白，在类囊体早期发育以及光胁迫条件下积累；后续光生物学研究证实，胁迫诱导下 ELIP 的积累与光抑制过程中光系统 Ⅱ（PSⅡ）反应中心 D1 蛋白的快速降解和周转密切相关 5。
模式植物与作物中已经对 LHC 超家族的基因组组成、复制起源以及功能开展系统研究，包括拟南芥、水稻、木薯 1314。陆地棉中的功能研究进一步表明部分家族成员如GhLhcb2.3 参与叶绿素 a 的生物合成 15。从藻类到被子植物的大范围比较基因组研究解析了该基因家族的系统发育关系、拷贝数变异（CNV）以及保守基序分布 16。除基础捕光功能之外，ELIP 亚家族还参与多种环境应答：例如豌豆中 ELIP 受强光诱导积累 5；回卷藓中参与耐脱水与耐盐胁迫 10；莱茵衣藻中参与低温诱导的光保护 12。多个物种研究均表明 ELIP 参与非生物胁迫耐受 5,10,12,1718，但目前尚未针对抗逆性突出的菊科，尤其是黄花蒿开展该超家族的系统解析。
本研究利用比较基因组对 24 种植物的 LHC 超家族进行系统分析，发现黄花蒿及其近缘物种中该超家族近期由基因复制驱动发生扩张。基于 4 套黄花蒿单倍型基因组，共鉴定得到 229 个 LHC 基因；ELIP 亚家族经历大量串联重复，并演化出保守的单外显子基因结构。对 41 份自然个体的群体基因组分析发现该亚家族在自然群体中存在拷贝数动态变异。值得关注的是，一个结构受损的 ELIP 等位基因仍可转录，产生较长的异常转录本，证明该亚家族仍处于活跃进化。UVB 胁迫转录组结果显示，多个AaELIP 位点同步强烈上调，但表达量存在差异，说明串联扩张的基因簇内部发生功能分化。综上，基因复制、结构进化以及表达分化共同塑造了黄花蒿特化的 UVB 响应型 ELIP 亚家族，有助于提升强光下的光保护能力，也为解析该药用植物光胁迫适应机制提供基因组依据。
材料与方法
LHC 基因鉴定与人工校正
从全球药典基因组数据库（GPGD，http://www.gpgenome.com/）下载 2 份黄花蒿品系（高青蒿素品系 HAN1、低青蒿素品系 LQ9）对应的 4 套单倍型基因组（LQ9P0、LQ9P1、HAN1P0、HAN1P1）的蛋白注释文件 19。以拟南芥 LHC 基因信息为参考（表 S1），初步筛选含有 3 个目标结构域（PF00504、PF00762、PF13806）的黄花蒿 LHC 候选基因。为实现无遗漏的全面鉴定，以拟南芥全部 LHC 蛋白作为查询序列，对 4 套黄花蒿单倍型蛋白注释数据集开展全基因组 BLASTP 搜索 20。
将得到的全部候选序列，利用 CDD、Pfam、InterPro 共 3 个数据库进行结构域验证 2123。基因分类标准：绝大多数 LHC 蛋白含有 PF00504 结构域；FCⅡ 与 Psb33 依据各自特有结构域（分别为 PF00762、PF13806），同时结合 C 端叶绿素结合区域进行界定。借助 Apollo 浏览器对候选 LHC 基因的基因结构逐一检查并人工校正 24。
比较基因组分析中，采用完全相同的分析流程，鉴定并整理其余 23 种植物的 LHC 基因（表 S2）。黄花蒿 LHC 基因座的等位基因判定标准：氨基酸序列一致性≥92%。利用 ProtParam 在线工具（https://web.expasy.org/protparam/）计算蛋白的氨基酸长度、等电点（pI）与分子量（MW）。使用 Clustal Omega v1.2.4 完成 LHC 全长蛋白多序列比对与两两相似度计算 25。进化树可视化与注释采用 R 包 ggtree v4.2.0 26；Ks 值计算使用 KaKsCalculator 3.0 27。
AaELIP 基因特征分析与拷贝数评估
使用 Clustal Omega 将 AaELIP 蛋白序列与拟南芥同源基因 ELIP1、ELIP2 进行多序列比对 25，比对结果使用 R 语言可视化。利用 41 份黄花蒿样本的基因组重测序数据评估 ELIP 基因座拷贝数（表 S3）。使用 bowtie2（2.4.4 版本）将高通量测序 reads 比对至 4 套单倍型参考基因组 28；提取比对到 ELIP 基因组区域的 reads，重新比对至 ELIP 参考基因座以提升比对精度。采用 bedtools（v1.6）计算测序深度 29。
对每个样本，计算全基因组平均测序深度作为全局测序深度；每个 ELIP 基因座的测序深度除以全局测序深度，得到归一化后的相对测序深度，本研究以此相对测序深度代表该基因座拷贝数。
ELIP 结构变异验证
采用改良 3×CTAB 法提取 LQ9 组培苗基因组 DNA 30；使用诺唯赞 FastPure 植物总 RNA 提取试剂盒提取总 RNA。利用 NanoDrop2000 超微量紫外分光光度计（赛默飞，美国）检测核酸浓度与纯度。使用 Primer Premier 5 设计基因特异性引物（表 S4）。
PCR 反应体系 25 μL：2×Phanta® Flash Master Mix (Dye Plus) 12.5 μL，上下游引物（10 μM）各 1.0 μL，基因组 DNA 模板 1.0 μL，无酶水补至 25 μL；PCR 扩增条件详见表 S4。PCR 产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳分离，使用牛津纳米孔 ONT 平台测序。测序 reads 通过 Minimap2（2.17 版本）比对到 LQ9P1 基因组中结构发生破坏的 ELIP 基因座 31，使用 IGV（整合基因组浏览器）可视化并人工核对基因结构 32。
植物材料与培养条件
黄花蒿种子由中国中医科学院中药研究所提供，经李响教授鉴定。种子置于湿润滤纸上，20 ℃、相对湿度 60% 黑暗条件下萌发；幼苗移栽塑料盆，自然环境下培养 4 周，之后转移至广州中医药大学温室培养 3 个月。选取长势均一健康幼苗 3 株（S1S3），置于人工气候室驯化一周；气候室设置光周期 16 h 光照 / 8 h 黑暗，相对湿度 60%，之后开展平行处理。
连续多天分别设置白光（WL）、UVB 紫外辐射处理，处理时长 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h，分别记为 WL0~WL8、UV0~UV8。照射过程中每 15 min 旋转植株，保证受光均匀。分别在 10:00、12:00、14:00、16:00、18:00 时间点，采集植株顶端下方 3 cm、5 cm、10 cm 位置完全展开叶片；样品迅速液氮冷冻，80 ℃保存备用。
RNA 提取、转录组测序与分析
使用诺唯赞 FastPure 植物总 RNA 提取试剂盒提取黄花蒿样品总 RNA；检测 RNA 质量后构建文库，Illumina 平台 150 bp 双端测序。过滤得到的 clean reads 使用 HISAT2（2.1.0）比对 LQ9P0 参考基因组 33；StringTie（1.3.4d）计算基因表达量 34。采用 DESeq2 筛选差异表达基因，阈值：|log₂倍数变化 |＞1，校正后P ＜0.05 35；利用 clusterProfiler 包完成差异基因 GO 功能富集分析 36。
整合表达分析：从 NCBI 下载已公开黄花蒿不同处理的 RNAseq 数据集，结合本课题组未发表的胁迫响应转录组数据集开展联合分析（表 S5）。
结果
菊科植物 LHC 超家族由近期基因复制驱动发生扩张
选取 24 种代表性植物开展 LHC 超家族基因鉴定，涵盖绿藻 1 种、苔藓 1 种、蕨类 1 种、裸子植物 1 种、基部被子植物 1 种、单子叶植物 2 种、双子叶植物 17 种（表 S2，图 1A）。不同物种 LHC 超家族基因数目介于 23158 之间。Lhc 亚家族基因数量最多，其次为 Lil 亚家族（包含 OHP、SEP、ELIP、Psb33）；PsbS 与 FCⅡ 亚家族拷贝数低，进化高度保守（图 1B，表 S6）。
与拟南芥（33 个）、番茄（43 个）、月季（35 个）等核心真双子叶植物相比，菊科类群的 LHC 超家族发生明显扩张。黄花蒿（不同单倍型 5465 个）、艾蒿（95 个）、甘菊（82 个）、莴苣（62 个）、向日葵（64 个）LHC 基因数量显著更高，扩张主要来源于 Lhc 亚家族与 ELIP 亚家族。普通小麦因六倍化基因组拥有极高的基因拷贝（158 个）；水稻（23）、无油樟（33）、买麻藤（23）等物种基因数目维持在较低至中等水平（图 1B，表 S6）。
为解析菊科 LHC 超家族扩张机制，选取 4 种菊科代表物种、4 种非菊科核心真双子叶物种，开展蛋白两两相似度分析。全部物种整体相似度分布趋势相近（图 S1）；但在序列相似度≥55% 的基因对中，菊科基因组高相似度基因对占比显著更高：艾蒿 21.77%～黄花蒿 45.93%；非菊科植物为月季 15.80%～番茄 25.25%（图 1C，表 S7）。对高相似度基因对（≥55%）的 Ks 分布分析显示，菊科物种在 Ks≈0.5 位置出现特征峰（图 1D），证明发生大量近期复制事件。综上，相对于其他核心真双子叶植物，黄花蒿及其近缘物种 LHC 超家族的扩张由谱系特异性的近期基因复制事件驱动。
图 1 LHC 超家族的比较基因组与进化分析
(A) 24 种物种的系统发育树：A. annua （黄花蒿）：HAN1P0/HAN1P1/LQ9P0/LQ9P1；A. argyi （艾蒿，Aarg）；C. lavandulifolium （甘菊，Clav）；E. canadensis （加拿大飞蓬，Ecan）；H. annuus （向日葵，Hann）；Arctium lappa （牛蒡，Alap）；Cichorium endivia （苦苣，Cend）；C. intybus （菊苣，Cint）；L. sativa （莴苣，Lsat）；Scaevola taccada （草海桐，Stac）；Daucus carota subsp. sativus （胡萝卜，Dcar）；R. chinensis （月季，Rchi）；Malus domestica （苹果，Mdom）；Nicotiana tabacum （烟草，Ntab）；S. lycopersicum （番茄，Slyc）；Camelina sativa （亚麻荠，Csat）；A. thaliana （拟南芥，Atha）；T. aestivum （普通小麦，Taes）；O. sativa （水稻，Osat）；A. trichopoda （无油樟，Atri）；G. montanum （买麻藤，Gmon）；Physcomitrium patens （小立碗藓，Ppat）；Adiantum capillusveneris （铁线蕨，Acap）；Chlamydomonas reinhardtii （莱茵衣藻，Crei）。 (B) 24 种植物的 LHC 家族成员数量分布；空心圆圈代表未鉴定到该类基因。 (C) 8 个物种中高相似度 LHC 基因对（序列一致性≥55%）在不同相似度区间的频次分布。 (D) 8 个物种种内 LHC 基因对（序列一致性≥55%）的 Ks 值分布；竖直虚线标记 Ks = 0.5。D 图右侧分组图例同时适用于 C 图。
黄花蒿 LHC 超家族：串联重复驱动的扩张与等位基因多样性
从黄花蒿两个品系的 4 套单倍型基因组中共鉴定得到 229 条 LHC 基因 37。共线性分析将其中 205 条基因划归为 40 个等位基因组（命名 AL1AL40），剩余 24 条为单倍型特有的基因座（图 2A，表 S8、S9）。检测到 11 个基因座发生串联重复，共包含 190 条基因。受等位基因座的有无、以及单个等位基因座内部串联拷贝数变异共同影响，不同单倍型基因组的AaLHC 基因数目差异显著（图 2B，表 S8）。其中AaLhcb （AaLhcb1 、AaLhcb2 、AaLhcb5 ）与AaELIP 亚家族发生显著的串联扩张，单个基因座拷贝数介于 28 之间（图 2B，表 S8）。
这些蛋白氨基酸长度为 108529 aa，分子量 5.5410.01 kDa（表 S9）。除AaFCⅡ 与AaPsb33 亚家族之外，绝大多数AaLHC 蛋白均含有特征性的叶绿素 a/b 结合结构域（PFAM 编号 PF00504）（图 2C）；所有鉴定得到的基因在 SUPERFAMILY 数据库中均注释为叶绿素 AB 结合蛋白（图 2D）。7 条基因因基因结构破坏或翻译提前终止被判定为假基因（表 S9）。
该超家族基因外显子数目跨度为 110 个，但黄花蒿同一亚家族内部基因结构高度保守（图 2E）。值得注意的是，全部AaLhcb1 与AaELIP 基因均为统一的单外显子结构，区别于其他亚家族的多外显子模式（图 2E，表 S9）。在更广的真双子叶植物范围内，Lhcb1 的外显子数目是可变的；核心真双子叶植物拟南芥、菊科姊妹类群草海桐（草海桐科）的 ELIP 同源基因仍保留多外显子结构，而本研究分析的所有菊科 ELIP 均为单外显子结构（表 S9、表 S10）。
鉴于菊科物种数量庞大，当前基因组数据集覆盖类群有限，该进化分布特征提示：单外显子结构很可能产生于菊科早期分化阶段或分化之后；但要确定其祖先状态，还需要更多菊科物种（尤其是基部类群）的基因组数据。此外，AaELIP 基因座内部、不同基因座之间的拷贝均具有很高的序列相似性（表 S10）。系统发育分析显示，同一科的 ELIP 大多聚为该科特有的单系分支（图 S2），说明不同植物类群的 ELIP 经历了各自独立的进化历程。
图 2 4 套单倍型基因组中 AaLHC 等位基因的系统发育关系与结构特征
(A) AaLHC 蛋白的最大似然（ML）系统发育树。分支按照亚家族进行着色，关键节点标注自举支持度。 (B) AaLHC 等位基因在 4 套单倍型基因组中的拷贝数分布。 (C) AaLHC 蛋白的 PFAM 结构域注释。 (D) AaLHC 蛋白的 SUPERFAMILY 数据库注释结果。 (E) AaLHC 等位基因的基因结构示意图。蓝色矩形代表编码序列；连接两个外显子的细蓝线代表内含子；两侧中等粗细条带代表 5′或 3′非翻译区（UTR）。
单外显子型 AaELIP 的进化起源与动态分化
为解析AaELIP 单外显子结构的进化起源，本研究对黄花蒿与拟南芥的 ELIP 基因开展对比分析。AaELIP 的单外显子区域，与拟南芥同源基因拼接后的多外显子编码区具有高度序列相似性，且二者空间位置一一对应（图 3A）。值得注意的是，黄花蒿基因组中未检测到与其姊妹类群草海桐（草海桐科）ELIP 内含子同源的序列；同时AaELIP 侧翼区域不存在逆转座子特征标记，例如靶位点重复（TSD）与 poly (A) 尾。
综上，编码区直接同源、无内含子残留、无转座特征，强烈支持谱系特异性内含子丢失模型 ，而非逆转座生成模型；但确切的分子机制仍有待进一步解析。
尽管菊科植物 ELIP 均保守为单外显子结构，但AaELIP 亚家族仍表现出极强的进化动态性。微共线性分析显示，不同等位基因座的串联重复拷贝数介于 513 之间（图 3B）。同一基因座内部以及不同基因组之间，所有重复拷贝与等位拷贝的两两序列一致性为 69.78%100%（图 3B，表 S11）。此外，41 份黄花蒿自然群体重测序数据揭示该基因座存在广泛的拷贝数变异，每个位点拷贝数为 14 个（图 3C，表 S12）。以上多态性特征表明黄花蒿 ELIP 亚家族仍处于活跃进化过程。
LQ9P1 基因组中一个特定结构变异等位基因（AL34.2）进一步印证这种进化动态：一段约 10 kb 的超长序列插入破坏了该基因典型的单外显子结构（图 3D）。基因组 reads 比对证实该位点并非组装错误。尽管基因结构遭到破坏，该位点依然具备转录活性。结合转录组、全长转录本与 PCR 数据联合分析发现，该位点产生 3 种不同的长转录本亚型：1949 bp 无内含子转录本、带有 92 bp 内含子的 1857 bp 转录本、以及包含 1142 bp 内含子的 807 bp 转录本（图 3D）。3 种转录本均丢失 LHC 特征结构域；而它的最近同源基因结构完整，能够产生正常 mRNA。
由于目前缺少功能验证，这些异常转录本究竟编码具有功能的新蛋白、充当调控型长非编码 RNA（lncRNA），还是仅仅是假基因退化过程产生的转录噪音，仍有待阐明。总而言之，内含子丢失、拷贝数动态变异、持续发生的结构变异，共同证明黄花蒿 ELIP 亚家族正经历十分活跃的进化转变。
图 3 AaELIP 的比较基因组与群体基因组分析
(A) 黄花蒿与拟南芥 ELIP 同源基因的基因结构及序列比对。蓝色矩形代表编码序列（CDS）；连接外显子的细线代表内含子；两侧中等粗细条带代表 5′或 3′非翻译区（UTR）。 (B) 4 套黄花蒿单倍型基因组中 ELIP 基因的微共线性与序列相似度矩阵。上图以 LQ9P0 基因组为参考展示 ELIP 基因座间的微共线性，连线连接共线性基因对，连线颜色依据序列一致性阈值设置；下方热图为全部 ELIP 蛋白两两之间的序列一致性矩阵。 (C) 41 份黄花蒿自然个体中核心 ELIP 基因座预估拷贝数热图。 (D) 基于 Nanopore 长读长测序解析 LQ9P1 单倍型中结构发生破坏的 ELIP 等位基因（AL34.2）的基因组结构与转录本图谱。比对轨道同时展示基因组 DNAPCR 比对结果（在基因组层面证实超长片段插入的真实存在）以及反转录 PCR（RTPCR）比对结果（展示转录水平产生的多种长转录本亚型结构）。
重复拷贝间表达存在差异：AaELIP 特异性响应 UV-B 胁迫
ELIP 在强光胁迫下发挥光保护功能已有较多报道，但该家族在黄花蒿中的特异性功能尚不明确 3840。多处理条件下AaELIP 的表达谱分析表明，该家族受光强烈诱导，尤其对紫外辐射响应显著（表 S4，图 S3）。为解析该响应过程，对黄花蒿开展不同时长 UVB 胁迫处理并进行转录组测序。2 h UVB 处理即可引发最剧烈的全局转录重编程；所有比较组共鉴定得到 1648 个上调差异基因、2396 个下调差异基因（图 4A）。
功能富集结果显示，上调差异基因主要富集于光信号通路（紫外、蓝光、红光、强光）、次生代谢以及光保护相关通路（图 4C）；下调差异基因多与核糖体组装、染色质组装等基础代谢过程相关（图 4D）。
全部 UVB 时间点共有的 118 个核心差异基因中，有 11 个隶属于 LHC 超家族，包含Lhcb1 、Lhcb7 、OHP2 、SEP2 以及多个 ELIP 基因座（图 4B）。值得注意的是，UVB 胁迫下所有AaELIP 基因座时间维度的诱导上调趋势高度同步（图 4E），但基因的绝对表达丰度存在明显分化（图 4F、图 S4）。同一基因座的等位基因（LQ9P0_AL33.1、LQ9P0_AL33.2）聚为一支，整体表达量偏低；而 LQ9P0_AL31、LQ9P0_AL32、LQ9P0_AL34 的等位基因形成另一分支，转录本丰度显著更高（图 4F、图 S4）。这种表达分化说明扩张形成的串联基因簇内部发生功能分化，分为主效功能拷贝与辅助功能拷贝。
植物中 ELIP 对光胁迫的响应在进化上保守（表 S4、图 S5）；而黄花蒿AaELIP 亚家族发生显著扩张，伴随强烈的基因组与转录组层面的动态变化，包括大规模串联重复、进化为单外显子的精简基因结构、群体水平拷贝数变异。综上，上述特征是一类重要的进化适应性改变，能够提升黄花蒿在原生生境中抵御强光与辐射胁迫的能力。
图注：黄花蒿 UV-B 胁迫下的转录组响应与功能富集
(A) 4 个时间点（2 h、4 h、6 h、8 h）UVB 处理组与白光对照组之间的差异表达基因（DEG）数目。 (B) 4 组比较共有差异基因的韦恩图。 (CD) 差异基因 GO 功能富集分析：(C) 上调基因；(D) 下调基因。 (E) 11 个 LHC 超家族核心差异基因热图，基于行 Zscore 标准化的Log10(TPM+1)数值绘制。 (F) 5 个 ELIP 基因座绝对表达量的非标准化热图。
讨论
本研究选取 24 种植物开展 LHC 超家族的比较基因组分析，并对黄花蒿两个品系的 4 套单倍型基因组进行深度解析。研究揭示了黄花蒿 LHC 超家族（重点为 ELIP 亚家族）的谱系特异性扩张模式、进化动态以及紫外胁迫应答机制。结果表明，黄花蒿及其近缘物种的 LHC 超家族发生扩张，主要由近期基因复制事件驱动；其中 ELIP 亚家族经历大规模串联重复扩张（图 2B）。
这种由串联重复驱动的 ELIP 谱系特异性扩张现象，在多种抗逆生物中均有报道，例如复苏植物回卷藓、牛耳草，以及松树、云杉等常绿裸子植物，该扩张有助于机体应对严酷环境约束 10,4143。大量植物研究证实 ELIP 介导光保护的功能具有进化保守性，莱茵衣藻、回卷藓、拟南芥中均得到验证 12,10,13。除响应光胁迫之外，ELIP 亚家族还能够整合多种非生物胁迫信号，牛耳草、裸子植物中 ELIP 可受低温、干旱显著诱导 4143。与之一致，黄花蒿中经串联重复扩张的AaELIP 基因座对 UVB 处理高度响应，且家族内部成员表达发生明显分化，提示AaELIP 参与光保护过程。
植物遭受强光胁迫时，非光化学淬灭（NPQ）与游离色素的有效封存是光保护的核心机制 9。已有研究表明 ELIP 定位于富集光系统 Ⅱ 的类囊体区域，紧邻易受损的 D1 蛋白；可作为临时储存载体捕获光诱导蛋白降解过程释放的游离叶绿素。ELIP 将高活性叶绿素与类胡萝卜素协同结合，通过静态 NPQ 途径耗散过剩激发能，进而抑制有害活性氧的生成 9。黄花蒿AaELIP 发生显著的串联扩张且成员表达分化，推测其构建了一套增强型分子缓冲网络，提升色素封存与热耗散能力，使光合系统在强辐射胁迫下保持稳定；但该推测仍有待实验验证。
AaELIP 亚家族具备十分独特的基因组特征：全部为统一的单外显子结构（表 S9，图 2E）。与双子叶模式植物拟南芥的序列比对及基因组分析表明，该精简的单外显子结构更可能来源于祖先基因的内含子丢失，而非逆转座事件，确切分子机制仍有待深入探究。从适应性角度来看，内含子剪接是真核生物基因表达中复杂且限速的步骤，内含子的维持与剪接会消耗大量能量，同时带来时间延迟 4445。在剧烈环境胁迫下，细胞剪接机器会受到强烈抑制，容易发生加工错误，产生异常转录本，限制多外显子功能基因的表达 4647。
基于黄花蒿AaELIP 演化出的单外显子特征，我们推测：单外显子结构可以让胁迫条件下光保护蛋白快速合成；跳过 RNA 剪接步骤能够显著加快AaELIP 转录本的翻译，使黄花蒿无需消耗额外时间与能量，即可快速大量合成 ELIP 蛋白，保护光合装置，应对快速变化的光照与 UVB 辐射。本研究还鉴定到一个保留转录活性、但结构遭到破坏的 ELIP 等位基因（图 3D）；受限于功能实验缺失，尚不清楚该位点转录本是编码新型功能蛋白、作为调控长非编码 RNA，抑或是假基因退化过程产生的转录噪音。
群体中仅少数个体存在拷贝数微小变异。为排除测序深度带来的干扰，本研究采用无 PCR 文库，降低扩增偏差。41 份黄花蒿重测序 reads 比对至参考基因组，所有个体基因组覆盖度稳定且均一，介于 85.64%88.39%，样本间可比性良好，证明拷贝数的小幅波动属于真实存在的低频群体多态性，并非测序假象。UVB 处理下不同AaELIP 成员的表达差异，暗示家族内部可能发生功能特化或存在基因剂量效应。但该结果仅停留在转录组层面，不能直接证明蛋白生物学功能存在差异；缺少直接实验证据是本研究的主要局限，单个AaELIP 基因座的确切功能仍不明确。
更广层面上，解析药用植物基因组结构，能够为中药材品质的遗传基础提供重要线索 37,4849。药用植物中，拷贝数变异、串联重复是应对环境胁迫的基因组储备，直接影响次生代谢物的积累与稳定性 5051。本研究对串联扩张AaELIP 基因簇的解析，展示基因组结构变异如何实现胁迫应答功能的分工，为理解野生黄花蒿群体的环境适应与抗逆特性提供参考。后续计划开展转基因功能实验，明确各AaELIP 基因在抗逆过程中的具体作用。
结论
综上，本研究在全基因组层面完成 24 种植物 LHC 超家族的比较分析，揭示黄花蒿 ELIP 亚家族独特的进化动态。研究证实近期串联重复驱动AaELIP 显著扩张，造成群体中等位基因多样性与拷贝数动态变异。结构上，AaELIP 统一的单外显子结构大概率起源于祖先基因内含子丢失；同时存在具备转录活性的结构破坏型等位基因，说明该亚家族仍处于活跃进化。UVB 胁迫条件下，各个AaELIP 基因座诱导上调的时间趋势高度同步，但表达水平存在明显分化，提示家族内部发生功能特化或存在基因剂量效应。我们认为，大规模串联扩张与基因结构精简是一项关键进化适应性特征，能够提升黄花蒿抵御强光与辐射胁迫的能力。本研究结果为后续解析黄花蒿适应复杂光环境的分子机制奠定重要基础。