Science Advances｜大语言模型增强宏基因组酶功能注释

摘要

宏基因组数据具有重要的生物学潜力，但其功能解读常受限于不完整的蛋白功能注释。准确的酶功能注释对于阐释宏基因组数据集中微生物群落的代谢能力至关重要。为应对这一挑战，作者开发了 FEDKEA （fine-tuned ESM-2 and distance-based KNN for Enzyme Annotation，基于微调 ESM-2 与距离 KNN 的酶注释工具），并提供配套的 Web 平台。此外，作者设计了一套用户友好的、基于 FEDKEA 的宏基因组流程 MEnzMap（Metagenomic Enzyme Map in microbes），涵盖从原始数据质控到功能预测及下游分析的完整工作流。将 MEnzMap 应用于 iHMP2 项目的人体肠道宏基因组数据，作者生成了健康个体与炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）患者全面的酶谱景观。这些工具为微生物暗物质的功能注释提供了高效方法，并促进疾病相关酶的识别。

Keywords：宏基因组；酶功能注释；大语言模型；蛋白质语言模型；ESM-2；FEDKEA；MEnzMap；EC 编号；微生物暗物质；炎症性肠病

文献信息

Zheng, L., Li, B., Xu, S., Chen, J., & Liang, G. (2026). Large language models enhance annotation of enzymes in metagenomes. Science Advances, 12, eaee4389.
DOI：https://doi.org/10.1126/sciadv.aee4389
期刊：Science Advances （IF ≈ 13.9，JCR Q1，中科院综合性期刊1区）
在线发表时间：2026 年 8 月 19 日

研究总结

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背景
宏基因组功能注释受困于微生物暗物质
人体微生物酶调控消化与宿主互作
现有酶注释工具在精度与适用性上受限
方法
UniProt Swiss-Prot 2024年前数据
微调ESM-2蛋白语言模型
层级EC编号预测框架
距离KNN处理少数类
MEnzMap宏基因组流程
iHMP2队列健康与IBD对比
主要结果
FEDKEA在酶识别F1达0.9485
四级EC预测精度超越主流深度学习工具
健康人核心酶以组氨酸激酶最普遍
IBD中抗氧化相关酶显著下降
Bacteroides来源过氧化氢酶在IBD中耗竭
意义
为微生物暗物质功能注释提供高效路径
揭示IBD中氧化应激响应的酶水平重塑

背景介绍

微生物组由栖息于人体各部位的高度多样且复杂的微生物群落构成，在健康与疾病中发挥关键作用。高通量测序技术的出现彻底改变了微生物组研究，产生了海量宏基因组测序数据。然而，这些宏基因组数据集的功能注释仍是一项重大挑战------许多微生物基因与通路仍未表征或知之甚少，常被称为微生物暗物质（microbial dark matter）。

人体微生物组产生的微生物酶在消化、生物合成、宿主-微生物互作及其他生理过程中发挥关键作用，对宿主健康至关重要，并为理解微生物组相关疾病提供线索，同时在纠正菌群失调方面具有治疗潜力。鉴于微生物组中大量未注释的蛋白功能，迫切需要通过新型计算方法对微生物酶功能进行注释。已有若干基于序列相似性、同源建模、结构分析、机器学习和深度学习的酶功能注释工具被开发出来并展现出前景；然而，在宏基因组分析方面仍有显著的改进空间。

本研究利用蛋白质大语言模型（protein large language models）与 EC（Enzyme Commission，酶学委员会）分类的层级结构 ，开发了 FEDKEA。为进一步契合宏基因组应用，作者基于 FEDKEA 开发了用户友好的流程 MEnzMap（Metagenomic Enzyme Map in microbes），涵盖从原始数据质控到功能预测及下游分析的整个工作流。作者重新分析了 iHMP2 项目的宏基因组数据以描绘人体微生物组的酶学景观，并识别出炎症性肠病患者相较于健康对照组抗氧化相关酶的减少。

重要结果

结果1：数据汇聚与 FEDKEA 模型架构

作者收集了 2024 年前 UniProt Swiss-Prot 数据库中的蛋白序列用于模型开发。2024 年前的 UniProt Swiss-Prot 数据库共包含 482,290 条蛋白序列，其中 233,921 条带 EC 编号的序列经实验验证为酶（Fig. 1A）。作者排除了占总酶数 6.9% 的多功能酶，聚焦于单功能酶的预测，最终获得 217,828 条酶序列与 248,369 条非酶序列，分别作为酶识别任务的阳性与阴性对照。所有数据按 8:1:1 比例分层采样划分为训练集、验证集与测试集。

酶的分类学分布分析显示，151,110 条酶（69.4%）来源于细菌，54,493 条（25.0%）来源于真核生物，9,960 条（4.6%）来源于古菌，2,265 条（1.0%）来源于病毒（Fig. 1C）。细菌与真核生物共享 858 个不同的 EC 编号，细菌与古菌共享 494 个，细菌与病毒共享 68 个（Fig. 1D）。鉴于宏基因组数据的复杂性及跨界具有相同 EC 编号的酶之潜在存在，作者选择纳入所有分类学的酶用于模型开发。

模型构建中发现，184,386 条酶具有完整的四级 EC 编号，占总量的 84.6%，其余缺乏完整四级 EC 编号（fig. S1B）。考虑到 EC 编号的层级结构以及不完整 EC 编号酶的存在，模型采用层级递进预测每一级 EC 编号的策略。同时，针对数据集的数据不平衡问题------410 个 EC 编号各包含超过 100 条蛋白，而大多数（3,451 个）仅由 1-10 条蛋白代表（Fig. 1B）------作者使用 MLP（Multilayer Perceptron，多层感知机）分类器 识别酶并预测前几级 EC 编号（这些级别拥有足够样本用于模型训练）；而使用基于距离的 KNN（K-Nearest Neighbor，K近邻）模型 这一零样本方法恢复最后几级 EC 编号，以辅助少数类的注释。所有分类器均以微调后的 ESM-2 嵌入作为输入。在识别酶时微调 ESM-2 的最后四层，预测 EC 编号时微调最后三层。为选择 KNN 的超参数 k，作者评估了 k=1、3、5、7、9，观察到 k=1 时精度最高（table S1）。这些框架最终集成为 FEDKEA------一个同时实现酶识别与 EC 编号预测的集成模型（Fig. 1E）。

Figure 1 图例：(A) 2024 年前 UniProt Swiss-Prot 数据库酶序列统计；(B) EC 编号的样本数分布，显示严重的数据不平衡；© 酶的分类学来源分布；(D) 不同界间共享 EC 编号数量；(E) FEDKEA 整体模型架构，包含酶识别与层级 EC 编号预测。

结果2：微调策略与消融实验验证

为解析微调的贡献，作者进行了消融分析。在酶识别任务中，微调模型达到峰值 F1 = 0.913，略优于未微调模型（Fig. 2A）。微调层数消融表明，微调 ESM-2 最后四层在各项评估指标上均取得最佳性能（fig. S2A）。为评估模型在低相似度序列上的鲁棒性，作者使用 CD-HIT-2D 构建了 90% 与 40% 序列同一性阈值的两个额外测试集。尽管性能随相似度降低而略有下降，但微调模型在准确率、精确率、召回率、F1 分数、AP 与 AUC 等指标上始终优于未微调模型（Fig. 2B 及 fig. S2 B-F）。

对于一级 EC 预测，微调模型在测试数据上平均 F1 得分为 0.8829，而未微调模型为 0.8656（Fig. 2C）。第 33 层嵌入的 t-SNE 可视化进一步显示，微调模型比未调模型更清晰地区分七个酶类（Fig. 2D, E）。类似地，微调层数消融证明微调三层效果最佳（fig. S3A），90% 与 40% 相似度测试集也证实了准确率、平均精确率、平均召回率与平均 F1 分数的持续提升（Fig. 2F 及 fig. S3 B-D）。

Figure 2 图例：(A) 微调与未微调二分类模型在测试集上各项性能指标（准确率、精确率、召回率、AUC、AP、F1）的对比；(B) 不同序列相似度测试集下两模型的准确率比较；© 一级 EC 编号预测中微调与未微调模型的性能对比；(D, E) 模型第 33 层嵌入的 t-SNE 可视化；(F) 不同序列相似度下一级 EC 预测模型的准确率比较。

结果3：FEDKEA 与主流酶注释工具的基准比较

作者通过将 FEDKEA 与四个近期发表的基于深度学习的 EC 编号注释工具------CLEAN 、GraphEC 、ECRECer 与 DeepEC------系统比较，考察其预测性能。CLEAN 使用来自 UniProtKB/Swiss-Prot 的完整 EC 编号酶，采用对比学习策略，但仅限于 EC 编号预测，不支持酶识别。GraphEC 在相同数据集上训练，使用几何图学习框架整合 ESMFold 预测的蛋白结构与预训练蛋白质语言模型，同样仅限于 EC 编号预测。ECRECer 采用层级双核多任务学习框架，可同时预测酶身份与 EC 编号。DeepEC 使用卷积神经网络高效识别酶并预测 EC 编号。

作者构建了独立测试集 UniProtKB 2025_05------包含 2024 年 1 月 1 日至 2025 年 5 月 9 日发布的 1,451 条酶序列与 1,426 条非酶序列，所有序列均严格排除在待测模型的训练数据之外，以确保无偏基准验证。

在酶识别任务中，FEDKEA 在各种多标签精度指标上均取得最高分，包括准确率（0.9486）、精确率（0.9585）、召回率（0.9387）与 F1 分数（0.9485）（Fig. 3A）。为专门评估 FEDKEA 在低同一性序列上的性能，作者合并 FEDKEA 与 ECRECer 训练集、去冗余并消除标签冲突，使用 MMseqs2 将二分类测试集与该统一数据集比对，构建不同同一性级别的测试数据集。在 UniProtKB_2025_05 基准上，FEDKEA 在所有同一性级别（包括 ≤30% 级别）的各项指标上均取得最高分（Fig. 3B 及 fig. S4 A-C）。

对于 EC 编号预测，作者在来自不同来源的两个独立测试集 Price-180 与 NEW-691 上评估性能，两者均包含多功能酶。FEDKEA 在不同 EC 级别上均优于其他方法，在 NEW-691 上四级 EC 准确率达 0.4964 ，在 Price-180 上达 0.3556（Fig. 3C, D）。在仅保留单功能酶子集（NEW-657 与 Price-166）的公平比较下，FEDKEA 表现出优于所有其他方法的性能（Fig. 3E 及 fig. S4 J-K）。为排除训练集相似度偏差，作者使用 Needleman-Wunsch 算法全局比对，移除更接近 FEDKEA 训练集的序列后，FEDKEA 仍保持最高精度。在 NEW-691 的低同一性（≤30%）子集上，FEDKEA 持续优于 CLEAN、GraphEC 与 ECRECer（Fig. 3F 及 fig. S4 T-V）。此外，在 NEW-691 与 Price-180 中定义为训练集少于 10 条序列的少数类中，NEW-691 的 116 条蛋白中有 52.6%、Price-180 的 72 条蛋白中有 58.3% 在全部四级 EC 上被准确预测，表明 FEDKEA 对实验注释有限的稀有酶类仍保留中度预测能力（Fig. 3G, H）。

Figure 3 图例：(A) UniProtKB_2025_05 上酶识别任务各工具性能对比；(B) 不同序列同一性水平下 FEDKEA 与 ECRECer 的酶识别准确率；(C, D) NEW-691 与 Price-180 上四级 EC 预测准确率对比；(E) 单功能酶子集上的性能对比；(F) NEW-691 低同一性子集上的四级 EC 预测性能；(G, H) 少数类酶预测准确率。

结果4：健康人体肠道微生物组的酶学景观

作者进一步开发了新型流程 MEnzMap，可利用宏基因组数据识别编码酶的微生物基因（Fig. 4A）。MEnzMap 首先质控测序数据，随后使用 SPAdes 或 Megahit 将 reads 组装为高质量重叠群（contigs），再用 Metabat2 将重叠群分箱（binning），通过 CheckM 评估分箱质量，仅选取高质量分箱进行后续分析。使用 Prodigal 预测这些高质量分箱的完整蛋白 ORF 序列，然后应用 FEDKEA 识别潜在的微生物酶基因。

作者应用 MEnzMap 通过 iHMP2 项目中 126 名健康个体的宏基因组数据，系统刻画酶学景观。作者识别出在所有受试者中普遍存在的核心酶集合。这些核心酶------主要参与复制、转录、翻译、细胞壁生物合成与代谢通路等基本生物过程（fig. S5）------代表了健康人体微生物组的基本功能元件。其中，**组氨酸激酶（histidine kinase, EC 2.7.13.3）**最为普遍，存在于所有健康受试者（n=126）中，并在 103 个个体中表现为丰度最高的酶。Wilcoxon 秩和检验证明组氨酸激酶与所有其他功能酶之间存在显著丰度差异（P<0.05）。

MEnzMap 能够刻画这些核心酶的分类学来源。例如，预测编码组氨酸激酶的基因在健康人体微生物组内所有微生物分类单元基因组中普遍存在（fig. S6）。值得注意的是，**拟杆菌属（Bacteroides）**中这些基因的普遍程度显著高于非拟杆菌分类单元（Fig. 4B）。此外，给定微生物物种内组氨酸激酶基因的数量与肠道生态系统中微生物总 ORF 数呈正相关（Fig. 4C）。

鉴于氧化应激响应能力对维持微生物稳态的关键作用，作者进一步研究了所有氧化应激相关酶在个体间的分布模式，揭示了从普遍存在于所有个体到仅限于特定人群子集的普遍程度谱系（Fig. 4D）。对于分布广泛且丰度水平相当的酶，其微生物来源表现出显著的个体间差异。例如，虽然硫氧还蛋白-二硫键还原酶（thioredoxin-disulfide reductase）在所有个体中普遍存在，但其微生物来源在某些个体中为单一主导分类单元，在其他个体中则为多样化分类单元阵列。除通用氧化应激酶外，作者还识别出一个酶子集------包括超氧化物还原酶（superoxide reductases）、铁氧还蛋白氢化酶（ferredoxin hydrogenases）与谷胱甘肽酰胺还原酶（glutathione amide reductases）------仅特定于某些个体，存在于不到 15% 的人群中，且通常由特定微生物分类单元编码。例如，超氧化物还原酶主要由 Bacteroides uniformis 编码。

Figure 4 图例：(A) MEnzMap 流程概览；(B) 拟杆菌属与非拟杆菌分类单元中组氨酸激酶基因的普遍程度对比；© 微生物总 ORF 数与组氨酸激酶基因数的正相关；(D) 健康人群中氧化应激相关酶的普遍程度谱系及微生物来源多样性。

结果5：炎症性肠病患者酶谱的改变

作者使用 MEnzMap 流程分析了 iHMP2 项目中 126 名健康个体、88 名克罗恩病（Crohn's disease, CD）患者与 72 名溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）患者的肠道微生物组酶学景观。作者还识别了所有 CD 患者或所有 UC 患者中存在的核心功能酶（figs. S7, S8）。值得注意的是，IBD（包括 CD 与 UC）患者的核心功能酶与健康个体之间存在大量重叠（fig. S9），表明关键酶功能在健康与疾病间基本保守。这些核心酶大多参与基本生物过程，包括核酸代谢、蛋白修饰、细胞壁相关活动、能量代谢与信号转导。

进一步分析揭示了健康个体与 IBD 患者间酶丰度与多样性的显著差异模式。UC 组的微生物酶多样性较健康对照组显著降低（P=0.033）（Fig. 5A），表明功能多样性明显丧失。健康、CD 与 UC 组的酶谱形成显著不同的簇（PERMANOVA），反映出 IBD 相关菌群失调不仅是分类学的，也是功能性的。

与健康个体相比，若干酶类的丰度发生显著改变。氧化还原酶（Oxidoreductases, EC 1.-.-.-）在 UC 患者中相对丰度显著升高（P=0.009） ；水解酶（Hydrolases, EC 3.-.-.-）在 UC 患者中相对丰度显著降低（P=0.040） ；连接酶（Ligases, EC 6.-.-.-）在 CD 患者中也显著降低（P=0.011）。值得注意的是，参与碳水化合物与氨基酸代谢的酶在 CD 与 UC 患者中均大幅耗竭（Fig. 5C），提示关键代谢通路（特别是与短链脂肪酸产生和营养加工相关的通路）受损。相比之下，某些与氧化应激响应相关的酶类在 IBD 中富集（Fig. 5D, E），反映了对炎症肠道中升高的氧化应激的潜在适应性微生物响应。然而，虽然某些氧化还原酶类富集，特定的抗氧化酶（如 EC 1.11.1.1、EC 1.11.1.6 与 EC 1.15.1.1）在 CD 患者中却出现耗竭（tables S6-S8），提示肠道微生物组内存在复杂且可能失衡的氧化应激响应。

作者进一步考察了过氧化氢酶（catalases, EC 1.11.1.6）在健康个体、CD 与 UC 患者中的微生物组分布，发现来自 Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides dorei 与 Prevotella sp. 的过氧化氢酶在 IBD 中完全耗竭（Fig. 5F 及 figs. S10-S12），提示抗氧化酶产生的丧失可能是维持肠道稳态与限制炎症的重要机制。

Figure 5 图例：(A) UC 组酶多样性（Shannon 指数）显著低于健康对照组；(B) 健康、CD、UC 三组酶谱的 PERMANOVA 聚类；© 各 EC 大类及碳水化合物/氨基酸代谢相关酶在组间的丰度差异；(D, E) 氧化应激响应相关酶在 IBD 中的富集情况；(F) 来自 B. thetaiotaomicron、B. dorei 等的过氧化氢酶在 IBD 中完全耗竭。

方法学参考

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fastp质控加host去除

bowtie2过滤宿主序列
组装

SPAdes或MEGAHIT
分箱

MetaBAT2或ComeBin
质量评估

CheckM completeness≥90 percent contamination≤5 percent
高质量bins中ORF预测

Prodigal meta模式
FEDKEA酶注释

微调ESM-2嵌入加MLP加KNN
酶丰度量化

RPKM标准化
酶多样性与组间差异

Shannon指数加PERMANOVA
健康与IBD酶谱比较

可供参考的关键方法 ：① 使用 CD-HIT 在 100% 同一性下去冗余，构建 482,290 条蛋白的非冗余训练集；② 采用 层级预测策略 ------前几级 EC 使用 MLP 分类器（样本充足），最后一级使用距离加权 KNN（zero-shot，处理少数类）；③ 微调 ESM-2 的最后三/四层，在 33 层 6.5 亿参数模型上获得任务优化的蛋白嵌入；④ 通过 CD-HIT-2D 构建 90% 与 40% 同一性阈值的测试集，系统评估低相似度场景下的鲁棒性；⑤ MEnzMap 流程中严格筛选高质量 bins（完整性≥90%、污染≤5%），随后以 RPKM（reads per kilobase per million mapped reads）量化酶丰度，使用 Shannon 指数评估酶多样性，PERMANOVA 评估组间差异。

总结

本研究针对宏基因组功能注释受困于微生物暗物质的挑战，开发了基于蛋白质大语言模型的酶注释工具 FEDKEA 及其配套的宏基因组流程 MEnzMap。FEDKEA 利用微调后的 ESM-2 嵌入，结合 EC 编号的层级结构，采用 MLP 分类器逐级预测前几级 EC 编号，并以距离 KNN 模型处理数据稀疏的最后一级，在酶识别任务中达到 F1=0.9485，在四级 EC 编号预测上超越 CLEAN、GraphEC、ECRECer 与 DeepEC 等主流深度学习工具，尤其在低序列同一性（≤30%）场景下保持优越性能。

基于 FEDKEA 的 MEnzMap 流程被应用于 iHMP2 项目的人体肠道宏基因组，首次在人群尺度上绘制了健康个体与 IBD 患者的酶学景观。研究发现组氨酸激酶（EC 2.7.13.3）是健康人体肠道中最普遍的酶 ，在 126 名健康个体中全部存在，并且拟杆菌属显著富集该酶基因。更为重要的是，通过健康与 IBD 的对比分析，研究揭示了 IBD 中抗氧化相关酶（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶）的显著下降------特别是来自 B. thetaiotaomicron、B. dorei 等拟杆菌的过氧化氢酶在 IBD 中完全耗竭；与此同时，UC 患者中氧化还原酶整体相对丰度升高，而水解酶与连接酶显著降低，碳水化合物与氨基酸代谢相关酶大幅耗竭。这些发现共同指向 IBD 中氧化应激响应的复杂重塑：一方面炎症肠道升高的氧化应激驱使某些氧化还原酶富集，另一方面关键抗氧化酶的产生能力下降，可能形成"炎症-氧化应激-菌群失调"的正反馈环路。

作者也审慎指出了 FEDKEA 的局限性：由于酶数据的不平衡，少数类的预测精度仍有限；当前模型无法注释多功能酶（仅占数据库 6.9%，但实际比例可能更高）；跨界功能转移（特别是真核酶数据用于预测原核蛋白功能）需谨慎解读。未来改进方向包括引入数据增强或少样本学习提升少数类性能、整合域水平预测或多标签分类以处理多功能酶、以及融入更丰富的不确定性校准。

总之，FEDKEA 与 MEnzMap 为微生物暗物质的功能注释提供了高效方法，并通过释放本研究生成的精心整理的数据集，旨在促进社区复用与基准测试，加速对宏基因组"暗物质"的探索。这些工具可进一步扩展至更好地处理多功能酶、融入不确定性校准，并推动从功能预测走向蛋白设计与工程化，深化我们在复杂生物系统中解读与操纵酶功能的能力。

参考文献

Zheng, L., Li, B., Xu, S., Chen, J., & Liang, G. (2026). Large language models enhance annotation of enzymes in metagenomes. Science Advances, 12, eaee4389. https://doi.org/10.1126/sciadv.aee4389
训练数据与独立测试集：https://zenodo.org/records/19727805 ；测试集：https://github.com/Stevenleizheng/FEDKEA/tree/main/Testset/data
FEDKEA 代码：https://github.com/Stevenleizheng/FEDKEA ；MEnzMap 代码：https://github.com/Stevenleizheng/MEnzMap
FEDKEA Web 平台：www.viromelab.com/software/fedkea
iHMP2 宏基因组数据：NCBI SRA BioProject PRJNA398089
Science Advances 期刊主页：https://www.science.org/journal/sciadv （2026 IF ≈ 13.9, JCR Q1）