骆驼科动物体内存在一类不寻常的免疫球蛋白------重链抗体（HCAb），两条重链均缺少 CH1 结构域，无需轻链即可行使功能；位于其 N 端的 VHH 结构域（约 120 个氨基酸、15 kDa）独自承担抗原识别1。骆驼血清中常规 IgG1 与仅含重链的 IgG2、IgG3 共存（IgG2 铰链区长、IgG3 短），后两者在重链抗体的天然储备中占比较高，为利用乳样品鉴定纳米抗体提供了物质基础。
Shaker 在 2010 年以免疫白喉-破伤风疫苗的单峰骆驼为对象，利用蛋白 G 优先吸附 IgG1/IgG3、蛋白 A 对各亚类均有吸附的差异，通过顺序层析实现了三种 IgG 亚类的分离1。SDS-PAGE 显示 IgG1 变性后解离为约 50 kDa 重链与约 30 kDa 轻链，IgG2 因铰链区较长呈约 46 kDa 条带，IgG3 铰链区最短而仅在约 43 kDa 处出带------该迁移行为构成亚类鉴别的典型分子量指标。
与血清相比，乳样品天然无创、可在泌乳期内反复采集，适合对动物免疫反应做时间维度的纵向监测。乳清制备需先以低温离心去除脂肪层，再用醋酸缓冲液将 pH 调至约 4.5 使酪蛋白凝聚沉淀，回收上清；该过程须控制 pH 与温度变化速度，避免 IgG 局部变性影响后端亲和层析的重复性。
Blanc 等人 2009 年报道的 Melon Gel 一步排阻结合法，可将 IgG1 与重链 HC-IgG 以较高回收率收集于流穿组分，产物在 SPR 与配体印迹中仍保持抗原结合活性2。该法不必区分亚类即可获得总 IgG，适合以骆驼乳样品做整体抗体滴度盘点的免疫监测场景。
图1. 骆驼血清中 IgG1（常规四链抗体，约 160 kDa）与 IgG2、IgG3（仅含两条重链的重链抗体，约 100 kDa）结构对比。IgG2 铰链区较长，IgG3 铰链区较短，两者均不含轻链。来源：Shaker GH. Nanotechnol Sci Appl. 2010;3:29-35. Figure 1. PMCID: PMC3781745.
鉴定通常从定量、构象、活性三个维度展开：以 IgG 亚类特异性 ELISA 测定乳清中 IgG2/IgG3 浓度，配合 280 nm 吸光度监测洗脱组分；以还原-变性 SDS-PAGE（必要时配合抗体印迹）检查亚类完整性与纯度；再以 SPR 或 BLI 对纯化亚类与待测抗原做亲和力定量。后者同时作为下游筛选的输入------由总 IgG 中功能型 VHH 池的亲和力分布，可间接预估对应免疫方案在 VHH 噬菌体文库中的命中潜力3。
乳源与血源 VHH 另有两点差异需注意：一是物种间乳中重链抗体占比差别明显，骆驼可达约 75%，羊驼常在 10%--25% 区间，物种选择直接影响建库产量1；二是乳中 IgG 浓度较血清低 5--20 倍，脱脂去酪过程须尽量减少抗体损失，并在前处理缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，防止脂肪酶与内源蛋白酶降解 IgG。总体看，乳样品路径对动物刺激小、可重复性好，适合在免疫进程中纵向跟踪抗体变化。
图2. 骆驼乳中重链抗体（IgG2/IgG3）分离与检测流程示意。从骆驼乳出发，经离心脱脂、酸沉去酪蛋白，获得乳清样品；通过蛋白 G / 蛋白 A 亲和层析拆分 IgG 亚类；后续通过 ELISA 定量、SDS-PAGE、Western Blot、SPR/BLI 亲和力测定、NGS/质谱深度评估进行多维度鉴定（示意图，本文绘制）。
应用上，乳源 IgG2/IgG3 检测既是 VHH 开发的入口，也被用于被动免疫研究------骆驼乳的抗病原活性部分被归因于 IgG2/IgG3 经肠道时仍保留的结构与识别能力。结合乳源 VHH 序列解析，还可在乳样品中追溯抗原特异性抗体的多样性，为黏膜递送型单域抗体候选分子的开发提供序列资源12。
天津卡梅德生物针对骆驼纳米抗体的检测与鉴定搭建了完整工艺平台。乳源与血源样品可分别对应不同的预处理方案，前者提供无创纵向采样优势，后者适合需要较高 IgG 浓度的常规鉴定场景。蛋白 G / 蛋白 A 顺序层析与 Melon Gel 一步排阻法都在平台能力清单内；下游鉴定链覆盖 IgG 亚类特异性 ELISA、还原 SDS-PAGE、抗体印迹、SPR/BLI 亲和力定量以及基于质谱的 VHH 序列解析。可针对免疫驼、泌乳驼、未免疫驼等不同动物状态匹配前处理强度与取样频次，提供阶段性的抗体动态监测报告与最终蛋白/序列交付件。
参考文献
- Shaker GH. Evaluation of antidiphtheria toxin nanobodies. Nanotechnol Sci Appl. 2010;3:29-35. PMID: 24198468; PMCID: PMC3781745; DOI: 10.2147/NSA.S9591.
- Blanc MR, Anouassi A, Ahmed Abed M, et al. A one-step exclusion-binding procedure for the purification of functional heavy-chain and mammalian-type gamma-globulins from camelid sera. Biotechnol Appl Biochem. 2009;54(4):207-212. PMID: 19824883; DOI: 10.1042/BA20090208.
- Jin BK, Odongo S, Radwanska M, Magez S. NANOBODIES®: A Review of Generation, Diagnostics and Therapeutics. Int J Mol Sci. 2023;24(6):5994. PMID: 36983063; PMCID: PMC10057852; DOI: 10.3390/ijms24065994.