120万细胞大整合（自测+公共数据）：scRNA-seq 构建乳腺细胞图谱的完整思路（附生信复现资源）

为什么同样的年龄，有些人患乳腺癌的风险更高？生育经历和基因突变又是如何从细胞层面重塑乳腺环境的？

2024年3月28日，《Nature Genetics》杂志发表了来自剑桥大学Walid T. Khaled和John C. Marioni团队的研究，他们通过构建单细胞图谱揭示了成人乳腺在不同生理条件下细胞状态的稳态偏移。今天我们就来拆解一下这篇生信文章： A single-cell atlas enables mapping of homeostatic cellular shifts in the adult human breast。

研究概述

乳腺癌具有高度异质性，目前尚不清楚乳腺亚型在偏离稳态时如何导致这种异质性。该研究利用单细胞转录组测序技术，对来自55名女性捐赠者的80多万个细胞进行分析，建立了人类乳腺细胞图谱（HBCA）。通过对上皮、免疫和基质部分的41个细胞亚群进行鉴定，研究人员绘制了年龄、生育状况及BRCA1/2生殖系突变对乳腺细胞组成的影响。研究发现，即使在非癌组织中，BRCA1/2突变携带者的免疫细胞也已表现出免疫耗竭的特征，这表明免疫逃逸机制可能在肿瘤起始的极早期就已经出现。

实验设计

研究队列包括55名捐赠者：22例缩乳术样本、27例预防性乳房切除样本（含BRCA1/2突变或强家族史者）以及6例BRCA1突变者的对侧乳房切除样本。组织被预处理为富集上皮和富集间质/免疫的两个部分，随后通过10x Chromium平台进行单细胞捕获。对于上皮部分，还利用荧光激活细胞分选（FACS）富集了腔内祖细胞（LASP）。此外，研究团队还对30名捐赠者的样本进行了多重免疫荧光（Ultivue）验证。

研究结果

图1 ：建立了涵盖55名捐赠者、整合健康记录与生活方式信息的单细胞图谱框架。

图2 ：在上皮、基质和免疫三大类中鉴定出41个不同的细胞亚群及其特异性标记基因。

图3 ：分析显示年龄增长主要引起上皮细胞比例偏移，而生育经历则导致更广泛的间质和免疫微环境重塑。

图4 ：BRCA1/2突变携带者乳腺组织中免疫细胞比例显著上升，并伴有促炎性CD8 TC1细胞的富集。

图5 ：高风险捐赠者的上皮细胞和巨噬细胞中PDL1表达增加，且CD8 T细胞表现出TIGIT、LAG3等耗竭标志物上调。

图6 ：通过整合七个大型公共数据集，构建出包含210万个细胞的集成乳腺细胞图谱（iHBCA），从而实现不同单细胞数据集的细胞类型注释比较。

数据分析

生信分析

该研究涉及的组学技术仅为单细胞RNA测序（scRNA-seq）。

分析流程

1. 数据预处理：使用CellRanger进行条形码分配、解复用和UMI定量，通过Vireo区分 spike-in细胞，借助DropletUtils识别有效细胞，利用Scrublet结合过聚类方法去除双细胞，经过质量控制筛选出801,360个细胞用于后续分析。
1. 批次校正与降维聚类：基于高可变基因，使用scVI工具进行批次校正并生成潜在维度，构建KNN图后通过UMAP进行降维，采用Leiden聚类实现细胞亚群划分。
1. 细胞注释：依据已知标志基因、质量控制指标和差异基因分析结果，对聚类得到的细胞亚群进行注释，明确上皮、基质和免疫细胞区室的各细胞类型及亚群。
1. 差异分析：使用edgeR进行差异基因表达分析，采用Milo进行细胞亚群丰度差异分析，探究不同风险因素下的基因表达和细胞组成变化。
1. 其他分析：通过CellChat预测细胞间相互作用，利用inferCNV推断拷贝数变异，借助CellTypist构建分类器实现不同数据集的细胞类型映射，整合多个数据集形成iHBCA。