研究背景
生命活动离不开蛋白质之间、蛋白质与核酸之间的精细互作。这些互作的异常往往与癌症、神经退行性疾病等密切相关。然而，传统研究手段各有短板：亲和纯化依赖高质量抗体，细胞裂解和洗涤过程容易丢失弱或瞬时的结合；化学交联虽能稳定部分互作，却可能引入假阳性，且难以处理不溶性靶点。酵母双杂交及蛋白片段互补法虽适合高通量筛选，但受限于细胞器类型（如膜蛋白不适），过表达易造成假阳性，标签的空间位阻又可能导致假阴性。因此，研究者迫切需要能够在生理条件下原位解析分子互作的新型工具。
一、两种核心酶学标记策略
邻近标记（Proximity Labeling, PL）技术依赖两类工程化酶产生短寿命活性中间体，从而实现空间受限的标记。
过氧化物酶系统（APEX、HRP）：在过氧化氢存在下，该类酶将外加的生物素-苯酚转化为高反应活性的苯氧自由基。自由基只能标记与酶（即诱饵蛋白）空间上邻近的内源蛋白，距离稍远的蛋白则几乎不被标记。标记范围受自由基半衰期及细胞内淬灭剂（如谷胱甘肽）的调控。
生物素连接酶系统（BioID、TurboID）：该酶利用ATP和生物素催化生成活性中间体生物素-5'-AMP，该中间体扩散后同样优先标记邻近蛋白质。与过氧化物酶不同，其活性受细胞内胺类物质的影响。
两类方法的共同逻辑是：酶促产生的活性物种寿命极短，标记严格限定在诱饵蛋白周围。标记结束后裂解细胞，用链霉亲和素磁珠富集生物素标记的蛋白，经胰酶消化成肽段，再通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定。结合"诱饵-酶融合组"与"仅表达酶的空间参照组"的定量比率分析，即可筛选出真正的互作蛋白。
图1 基于过氧化物酶和生物素连接酶的邻近标记方法
二、邻近标记在蛋白质-核酸（RNA/DNA）互作中的应用
蛋白质-RNA互作：
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间接标记（需交联）：将APEX2靶向特定亚细胞区室，先标记邻近蛋白，再通过甲醛（APEX-RIP）或紫外线（Proximity-CLIP）使蛋白与RNA交联，最后用链霉亲和素富集蛋白-RNA复合物，从而捕获特定区域的蛋白-RNA互作。
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直接标记（无需交联）：以蛋白为中心的方法如APEX-seq、CAP-seq，分别利用APEX2直接标记邻近RNA，或利用miniSOG光产生活性氧标记RNA碱基，富集后测序即可鉴定互作RNA。以RNA为中心的方法如RaPID、MS2标签介导的PL及dCas13-based PL，通过BoxB适配体、MS2茎环或dCas13将生物素连接酶（BASU）或过氧化物酶（APEX2）靶向特定RNA（外源标记或内源RNA），实现对RNA结合蛋白的原位标记。
蛋白质-DNA互作 ：
以DNA为中心的邻近标记主要基于CRISPR靶向。dCas9-based PL将PL酶与dCas9融合，靶向特定基因组位点，标记邻近的DNA结合蛋白。ChromID则将PL酶（如BASU）与识别特定染色质修饰的"阅读器"结构域融合，从而标记与特定组蛋白修饰相关的蛋白质，弥补了传统ChIP-seq依赖抗体且难以靶向非特异性修饰的不足。
这些方法的设计精髓在于：利用邻近标记"原位标记"的特性，避开传统核酸互作研究中细胞裂解和交联的弊端；同时借助CRISPR或结构域融合实现空间精准靶向，形成适用于多种研究场景的PL技术体系。
图2 邻近标记（PL）技术在蛋白质-核酸（RNA与DNA）相互作用研究中的应用
三、邻近标记技术的核心优势
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活细胞/活体原位捕获：在生理状态下发挥作用，能够保留传统方法易丢失的弱互作和瞬时互作，且不依赖高亲和力抗体。
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灵活的时空分辨率：过氧化物酶类（如APEX2）可实现分钟级快速标记，适合追踪动态过程；生物素连接酶类（如TurboID）无显著细胞毒性，适合长期体内研究（小鼠、植物等）。结合诱导二聚化、分裂酶等策略，可进一步提升亚细胞特异性，精细解析核膜、线粒体膜等区域的互作网络。
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广泛的适用性：不仅用于蛋白质-蛋白质互作，还可通过适配交联、CRISPR靶向等策略，拓展至蛋白质-RNA、蛋白质-DNA互作，适用于从体外细胞系到多个物种体内系统的多层次研究。