稀疏单分子荧光信号采用千眼狼（Revealer）低噪声sCMOS相机结合TIRF全内反射荧光显微镜捕获。
1.实验背景
光激活定位显微术（PALM）通过稀疏激活和单分子拟合，实现约20~30 nm量级的超分辨图像，是细胞生物学研究中的核心工具。
PALM分辨率不仅受显微物镜数值孔径限制，更取决于单分子光子数、背景噪声、像素采样率及定位算法精度。其中探测器性能直接影响单分子定位精度，传统PALM系统多采用EMCCD相机，其增益放大虽能探测弱信号，但乘性噪声、大像元、有限动态范围限制了定位精度。近年，随着sCMOS技术快速发展，读出噪声大幅降低，且具备无乘性噪声、更高帧率和更小像元的优势，某科研团队引入千眼狼（Revealer）新型sCMOS相机Gloria 6504，评估其在TIRF-PALM成像体系中的单分子探测能力和数据质量，为细胞膜蛋白及近膜动态过程研究提供技术验证。
2.实验设备
实验平台由全内反射荧光显微镜（TIRF）与sCMOS探测系统组成。
显微成像部分采用Nikon倒置显微镜，配置TIRF照明模块，物镜配置100×NA 1.49高数值孔径油浸物镜；荧光激发采用488 nm激光，用于激发已激活的GFP单分子荧光，405 nm激光器用于稀疏激活光转换荧光蛋白，通过声光可调滤波器调节功率。
核心探测器采用千眼狼（Revealer）Gloria 6504 sCMOS相机，像元尺寸6.5 μm×6.5 μm，分辨率2048×2048，全画幅帧率可达291 fps，16 bit HDR输出，读出噪声仅0.7 e- 。该配置在保证大视场同时，可实现亚像素及单分子采样，为PALM成像提供高信噪比、高速连续采集能力。
3.实验方法
实验遵循PALM标准工程流程：
首先通过低功率TIRF照明寻找焦平面，确认细胞形态和荧光标记表达均匀性；
随后启动PALM采集序列，以405 nm激光实现稀疏光激活，同时以488 nm激光持续激发已激活的荧光分子
第三步设置sCMOS相机Gloria 6504的ROI分辨率为1024×1024，曝光时间25 ms，每个激活-激发周期以40 fps采集1200帧图像序列；
随后通过单分子定位算法对每个光斑进行二维高斯拟合，计算荧光分子中心坐标。最终将数万至数百万定位事件叠加重建，获得超分辨率重构图像。
本实验主要关注原始单分子信号的探测质量：单分子光斑原始信号的可识别性、背景噪声及信噪比特征，为后续高精度重建提供基础。
4. 实验数据
持续激发条件下，视场中出现大量离散分布、随机闪烁的点状荧光信号，空间尺寸接近系统衍射极限，时间呈现随机出现与消失特征，符合单分子行为标准。
背景强度评估，TIRF照明的薄层激发，有效抑制离焦杂散光，使每帧图像中单分子光斑与背景之间形成较高对比度。低背景环境对于单分子识别尤为重要，减少伪定位事件。
光斑形态上，序列图像中的单分子信号呈规则圆形或近圆形PSF分布，未见明显压缩或畸变现象，表明显微系统光路校准精确，sCMOS相机像素采样完整记录单分子衍射斑，有利于后续高斯拟合定位精度。
读出噪声表现上，PALM实验关键挑战在于单分子荧光信号仅包含有限光子数，容易被sCMOS相机噪声淹没，降低定位精度。本次测试中，Gloria 6504 sCMOS相机捕捉到的单分子光斑边界清晰、背景波动小，说明相机能够较好地区分单分子事件与读出电子噪声，为亚像素级定位提供稳定数据基础。
图 Gloria 6504 捕获的25 ms-225 ms- 425 ms-825 ms-2025 ms-4450 ms单分子荧光图像
5. 实验结论
本次实验利用TIRF照明体系和低噪声sCMOS相机Gloria 6504有效捕获GFP标记贴壁细胞的单分子荧光信号，记录大量随机闪烁特征的单分子荧光事件，实验数据具备低背景、单分子可分离、高信噪比及稳定PSF形态等特征，满足后续单分子定位重构的数据质量要求。
sCMOS相机在像素密度、读出噪声、帧率及空间采样方面的优势，使其在单分子荧光领域具备超越传统EMCCD的潜力。对于膜蛋白组织、受体聚集行为以及近膜信号转导等细胞生物学研究，TIRF-sCMOS-PALM技术路径可提供可靠的单分子与超分辨率成像手段。