❝ 本文基于修改后的下游分析脚本 mRNA_QcAndQuant_2026-8-20.R ，系统讲解转录组下游差异分析与功能富集的完整流程：参数对结果的影响与比较、逐句语法分析、使用方法、在生信分析中的作用，并附加完整修改后 R 代码。
一、引言：下游分析，把表达矩阵翻译成生物学故事
RNA 测序经过质控、比对与定量等步骤后，得到了一张"基因 × 样本"的 count_matrix.txt 表达矩阵。但这只是"原材料"------它回答了"每个基因测到多少条 reads"，却还没有回答生物学家真正关心的问题：
① 处理组与对照组相比，哪些基因表达显著改变？（差异表达分析）
② 这些改变的基因富集在哪些通路和生物学过程？（GO/KEGG 富集分析）
③ 即使单个基因变化不显著，整条通路的表达是否协同改变？（GSEA 基因集富集分析）
下游分析正是完成"从数据到结论"的最后一步。本文要介绍的下游脚本 mRNA_QcAndQuant_2026-8-20.R 把这一过程标准化为一键运行：DESeq2 差异分析 → 5 种经典可视化 → 本地数据库 GO/KEGG 富集（无需联网）→ GSEA，最终在 05.results 目录输出一套完整的、可直接用于论文的结果文件。
二、分析流程全景图：一行命令，走完下游全流程
下游脚本以"基因表达矩阵"为输入、以"富集结果与可视化图表"为输出，全流程共 6 个模块，串联起差异分析、可视化和功能注释三大环节：
count_matrix.txt → DESeq2 差异分析 → 显著 DEGs （ |log2FC|>1, padj<0.05 ）
↓
5 种可视化（ MA/ 火山图 / 热图 /PCA/ 相关性热图）
↓
本地 GO 富集（ BP/CC/MF ） + 本地 KEGG 通路富集 → enrichment/
↓
GSEA 全基因排序富集分析 → gsea/
↓
📁 05.results/ 全套结果文件
脚本会在项目根目录下自动创建 05.results 结果目录，内部按功能拆分为四个子目录：
|-----------------|------------------------------------------------------|
| 子目录 | 内容 |
| DESeq2_results/ | 差异分析结果：全基因表、显著基因、上调/下调基因、标准化矩阵 |
| plots/ | 5 种可视化图：MA 图、火山图、热图、PCA 图、样本相关性热图 |
| enrichment/ | 本地 GO/KEGG 富集结果：CSV/XLS 表格 + 柱状图/气泡图 + 交互 HTML |
| gsea/ | GSEA 结果：gsea_result.xls + 显著基因集 gseaplot2 图（PDF/PNG） |
三、项目概述与数据来源：示例数据说明
本文使用的示例数据来自 GEO 数据库的 GSE52778（airway 数据集），这是转录组入门分析最经典的公开数据集之一：人气道平滑肌细胞经糖皮质激素（地塞米松，Dexamethasone）处理后，研究基因表达的系统性变化。数据可通过 GEO / SRA / ENA 三个渠道免费获取：
|----------|-------------------------------------------------------------|
| 数据来源 | 地址 |
| GEO 主页 | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE52778 |
| SRA 下载 | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra |
| ENA 下载 | https://www.ebi.ac.uk/ena |
示例数据共 8 个样本（4 Control + 4 Treat），本文演示使用其中 4 个样本。样本编号与分组信息如下：
|----------|----------------|--------------------------|---------|--------|
| 本地样本 | SRR 编号 | GEO 样本 (GSM) | 供体 | 处理 |
| Control1 | SRR1039512 | GSM1275866 | N052611 | 未处理 |
| Control2 | SRR1039520 | GSM1275874 | N061011 | 未处理 |
| Control3 | SRR1039516 | GSM1275870 | N080611 | 未处理 |
| Control4 | SRR1039508 | GSM1275862 | N61311 | 未处理 |
| Treat1 | SRR1039513 | GSM1275867 | N052611 | 地塞米松 |
| Treat2 | SRR1039521 | GSM1275875 | N061011 | 地塞米松 |
| Treat3 | SRR1039517 | GSM1275871 | N080611 | 地塞米松 |
| Treat4 | SRR1039509 | GSM1275863 | N61311 | 地塞米松 |
❝ 实验设计要点：同一供体（ N052611 等）同时有 Control 和 Treat 样本，构成 " 配对 / 生物学重复 " 结构，是 DESeq2 计算差异显著性统计基础的来源。
四、软件与环境准备：一键锁定的分析环境
下游分析建议在本地或云端的 RStudio Server 环境中运行，所有依赖包可由脚本自动安装，无需手动配置。
|------------|-------------------|------------------------------|
| 类别 | 软件 | 版本 |
| R 环境 | R（统计语言） | 4.3.3（BiocManager 3.18） |
| 差异分析 | DESeq2 | 1.42.1 |
| 富集分析 | clusterProfiler | 4.10.1 |
| 富集可视化 | enrichplot | 1.22.0 |
| GSEA 算法 | fgsea | 1.28.0（clusterProfiler 内置调用） |
| 火山图 | EnhancedVolcano | 1.28.2 |
| 热图 | pheatmap | 1.0.13 |
| 通用绘图 | ggplot2 | 4.0.3 |
| 数据处理 | dplyr / pbapply | 1.2.1 / 1.7.4 |
| 交互表格 | DT / htmlwidgets | 0.34.0 / 1.6.4 |
| ID 转换 | org.Hs.eg.db | 3.18.0（ENSG→Symbol） |
| GO DAG（可选） | topGO / Rgraphviz | 2.54.0 / 2.46.0 |
脚本内置"依赖自动安装"逻辑：若环境缺失某个包，会尝试从 CRAN/Bioconductor 自动安装，保证"拿到脚本即可运行"。
五、数据准备：三大文件夹与百度网盘
所有分析文件都组织在工作目录 RNA_seq/ 下，按"参考数据 - 原始数据 - 富集数据库"三分类管理，这是保证分析可复现的经典目录规范：
|-----------------------------|--------|------------------------------------------|
| 子项 | 类型 | 说明 |
| reference/ | 文件夹 | 参考基因组 + GTF 注释（比对与定量环节的输入文件） |
| raw_data/ | 文件夹 | 8 样本双端测序原始数据（.fq.gz ×16） |
| enrichDB/ | 文件夹 | 4 物种本地 GO/KEGG 基因集（GMT + KEGG 映射表，下游富集用） |
| mRNA_QcAndQuant_2026-8-20.R | R 脚本 | 下游差异与富集分析主脚本（本文主角） |
其中 enrichDB/ 目录是下游富集分析的关键数据库------它把原本需要联网调用的 GO/KEGG 注释打包为本地基因集文件，让富集分析在无外网环境下也能稳定运行：
|--------|--------|---------------------------|------------------------|
| 物种 | 代码 | GMT 注释库 | KEGG 映射表 |
| 人 | hsa | hsa.gmt（3.27 MB，19,041 条） | hsa_keggID2symbols.xls |
| 小鼠 | mmu | mmu.gmt（4.18 MB，19,515 条） | mmu_keggID2symbols.xls |
| 大鼠 | rat | rat.gmt（3.71 MB，19,375 条） | rat_keggID2symbols.xls |
| 拟南芥 | ath | ath.gmt（2.18 MB，7,395 条） | ath_keggID2symbols.xls |
以人的 hsa.gmt 为例，它共包含 19,041 条基因集注释，覆盖 GO 三大本体与 KEGG 通路：
|-------------|--------|---------------------------------------------------------|
| 类型 | 条数 | 示例 |
| GO-BP（生物过程） | 12,255 | GO:0002764 immune response-regulating signaling pathway |
| GO-MF（分子功能） | 4,588 | GO:0003674 molecular_function |
| GO-CC（细胞组分） | 1,835 | GO 细胞组分条目 |
| KEGG 通路 | 363 | hsa01100 Metabolic pathways |
| 合计 | 19,041 | --- |
❝ 为什么使用本地 GMT 而非在线注释？ ① 无需联网，运行稳定； ② 版本可控，结果可复现； ③ 支持 hsa/mmu/rat/ath 四种物种，覆盖绝大多数常规转录组项目。
六、零基础实操：从平台入口到一键运行
下面按平台实际操作步骤，演示如何用 R 语言基础环境运行下游脚本。全程无需安装任何软件，浏览器即可完成。
6.1 进入平台并登录
打开浏览器输入平台地址，进入平台首页（登录后可见 JupyterHub 与 RStudio 等工具入口卡片）：
图 8-1 登录平台后， RNA_seq 目录下的分析结果文件夹（ 01~04 ）
6.2 进入 R 语言基础（ RStudio Server ）
在工具入口卡片中点击 "R 语言基础"，浏览器将打开 RStudio Server 登录页：
图 8-2 平台工具入口卡片中的 "R 语言基础 " （ RStudio Server ）
6.3 登录 RStudio 并进入分析环境
使用平台账号登录 RStudio Server，进入熟悉的四窗口开发界面：
图 8-3 RStudio Server 登录页面
图 8-4 RStudio 主界面（脚本 / 控制台 / 环境 / 文件四窗口）
6.4 加载并运行下游脚本
在 RStudio 中打开 mRNA_QcAndQuant_2026-8-20.R，选中全部代码后点击 Run（或 Source），脚本自动完成参数设置、数据导入、差异分析、富集分析的全流程：
图 8-5 在 RStudio 中打开下游 R 脚本
6.5 查看运行结果
脚本运行结束后，RNA_seq 目录下自动生成 05.results 结果目录，包含差异分析表格、可视化图片、GO/KEGG 富集结果与 GSEA 结果：
图 8-6 R 脚本运行结束，生成 05.results 结果目录
❝ 💡 小白提示： RStudio 的 Source 按钮会静默执行整个脚本； Run 按钮则逐段执行。第一次运行时建议用 Run 观察每一步输出，确认数据导入与分组推断无误后再整段 Source 。
七、参数对结果的影响与比较：阈值决定你看到什么
下游分析中，几个关键阈值直接决定了"哪些基因算显著"、"哪些通路算富集"，进而影响整个结论。理解它们的含义，才能在严格与宽松之间做出科学选择。
7.1 差异表达分析阈值（决定 DEG 名单）
|---------------|---------|----------------------|----------------------|
| 参数 | 默认值 | 对结果的影响 | 调整建议 |
| PADJ_CUTOFF | 0.05 | 校正后 p 值阈值，控制假阳性 | 严格分析可设为 0.01 |
| LOG2FC_CUTOFF | 1 | 两倍变化（2^1=2 倍） | 探索性分析可放宽至 0.5（1.4 倍） |
| MIN_COUNT | 10 | 单样本最小 count | 低表达基因过滤，避免噪音 |
| MIN_SAMPLES | 2 | 至少 2 个样本满足 MIN_COUNT | 保证生物学重复间的可靠性 |
严格 vs 宽松的效果： 以本文数据为例，默认阈值（|log2FC|>1 且 padj<0.05）得到 18 个显著 DEGs（7 上调 + 11 下调）；若把 PADJ_CUTOFF 收紧到 0.01，DEG 数量会进一步缩减，结论更保守、更可信；若把 LOG2FC_CUTOFF 放宽到 0.5，则会纳入更多表达变化较小的基因，适合筛选"趋势性"候选基因。
7.2 富集分析参数（决定富集条目）
|--------------|-----------------|---------------------|
| 参数 | 脚本内设置 | 影响 |
| pvalueCutoff | 0.05（默认）→ 1（兜底） | 控制富集显著性，兜底避免无输出 |
| qvalueCutoff | 0.2（默认）→ 1（兜底） | FDR 控制，放宽可展示更多趋势性条目 |
| minGSSize | 1 | 允许小基因集富集，适合本地数据库 |
| maxGSSize | 1000 | 排除过大的基因集，避免泛化通路 |
脚本在默认阈值下若无显著富集条目，会自动"放宽阈值兜底"（pvalueCutoff=1, qvalueCutoff=1）重新富集，避免输出为空------这样既保证结果的严谨优先，又保证"永远有结果可看"。
7.3 GSEA 参数（决定富集算法行为）
|---------------|--------------|---------------------------|
| 参数 | 设置 | 作用 |
| eps | 1e-10（fgsea） | 数值精度，保证稳定性 |
| pAdjustMethod | BH | Benjamini-Hochberg FDR 校正 |
| seed | TRUE | 保证结果可重复 |
❝ 参数选择的黄金法则：默认阈值适合大多数场景；审稿人要求更严格时收紧 PADJ_CUTOFF ；前期探索阶段可适当放宽；所有阈值修改只需改动脚本开头的参数区，一处修改、全流程生效。
八、逐句语法分析：拆解下游 R 脚本
下面按脚本的 6 大功能模块，逐段解读关键代码的语法、用法与生信意义。为便于对照，代码段后的讲解对应脚本实际行。
8.1 参数设置区：脚本的 " 仪表盘 "
脚本开头集中定义所有关键参数，便于用户按需调整：
代码 8-1 参数设置区
# ========== 0. 参数设置 ==========
PADJ_CUTOFF <- 0.05 # 校正后 p 值阈值（差异显著）
LOG2FC_CUTOFF <- 1 # log2 倍数变化阈值（|log2FC|>1 即 2 倍）
MIN_COUNT <- 10 # 基因在单个样本中的最小 read 数
MIN_SAMPLES <- 2 # 至少 2 个样本满足 MIN_COUNT 才保留
WORK_DIR <- "/mnt/data/RNA_seq" # 工作目录（可按需修改）**逐句讲解：**① `<-` 是 R 的赋值运算符，等价于 `=`，表示把右侧值存入左侧变量；② 所有阈值集中在此，方便统一管理；③ 注释 `#` 后的内容不参与运行，仅作说明。
8.2 依赖包检查与自动安装：开箱即用
代码 8-2 依赖包检查与自动安装
# ========== 0.2 自动安装缺失包 ==========
install_pkg <- function(pkg, from = "CRAN") {
if (!requireNamespace(pkg, quietly = TRUE)) {
if (from == "Bioc") BiocManager::install(pkg, ask = FALSE, update = FALSE)
else install.packages(pkg, repos = "https://cloud.r-project.org")
}
}
install_pkg("DESeq2", "Bioc"); install_pkg("clusterProfiler", "Bioc")
install_pkg("EnhancedVolcano", "Bioc"); install_pkg("fgsea", "Bioc")**逐句讲解：**① `function(pkg, from)` 定义函数，`requireNamespace(pkg, quietly=TRUE)` 检查包是否已安装；② 未安装时，Bioconductor 包用 `BiocManager::install()`，CRAN 包用 `install.packages()`；③ `::` 符号调用包内函数，避免命名冲突（如 `BiocManager::install`）。
8.3 数据导入：三种容错方案
代码 8-3 表达矩阵导入（三方案容错）
# ========== 4. 导入表达矩阵 ==========
mat <- tryCatch(
read.table(file.path(proj_dir, "04.counts", "count_matrix.txt"),
header = TRUE, row.names = 1, sep = "\t", check.names = FALSE),
error = function(e) NULL)
if (is.null(mat)) {
# 方案二：重建表头（首列 Geneid，其余为样本名）
mat <- read.table(file, header = TRUE, row.names = 1, sep = "\t")
}
mat[is.na(mat)] <- 0 # 缺失值补 0**逐句讲解：**① `tryCatch(..., error=function(e) NULL)` 是 R 的异常处理机制：正常执行返回结果，出错返回 NULL 而不中断；② `read.table` 读入制表符分隔文件：`header=TRUE` 首行当表头，`row.names=1` 第一列当行名（基因名），`check.names=FALSE` 防止样本名被自动改写成合法变量名；③ `file.path()` 跨平台拼接路径，`\t` 是制表符转义。
8.4 自动分组推断：样本名前缀即分组
代码 8-4 自动分组推断
# ========== 5. 自动推断分组 ==========
sample_names <- colnames(mat)
get_group <- function(x) {
if (grepl("^Control|^Ctrl|^WT|^control", x)) return("Control")
if (grepl("^Treat|^Treat|^KO|^treat", x)) return("Treat")
return("Unknown")
}
group_info <- vapply(sample_names, get_group, character(1))
table(group_info) # 查看分组统计**逐句讲解：**① `grepl(pattern, x)` 用正则表达式匹配，返回 TRUE/FALSE；`^` 表示"以...开头"；`|` 表示"或"------因此 "Control"、"Ctrl"、"WT" 开头的样本都归为对照组；② `vapply(样本名, 函数, 返回值类型)` 对每个样本名执行分组函数，返回字符向量；③ 分组规则覆盖了最常见的命名习惯，遇到 "Unknown" 会触发警告，提示检查命名。
8.5 DESeq2 差异分析：下游核心
代码 8-5 DESeq2 差异分析核心
# ========== 7. DESeq2 差异分析 ==========
suppressPackageStartupMessages(library(DESeq2))
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(
countData = mat_filtered, # 过滤后的计数矩阵
colData = data.frame(condition = factor(group_info)),
design = ~ condition) # 实验设计公式
dds <- DESeq(dds) # 拟合负二项分布模型
res <- results(dds, contrast = c("condition", "Treat", "Control"))
res_df <- as.data.frame(res)
res_df$gene <- rownames(res_df)
sig <- res_df[!is.na(res_df$padj) &
res_df$padj < PADJ_CUTOFF &
abs(res_df$log2FoldChange) > LOG2FC_CUTOFF, ]**逐句讲解：**① `DESeqDataSetFromMatrix()` 把计数矩阵包装成 DESeq2 的数据对象，需同时提供：计数矩阵、样本信息（colData）、实验设计公式（design）；② `design = ~ condition` 用公式语法声明"只看分组这一因素"，这也是差异分析的统计模型骨架；③ `DESeq()` 完成估计大小因子、离散度、拟合模型三步；④ `results(contrast=c("condition","Treat","Control"))` 提取"Treat 相对 Control"的差异结果，返回 baseMean/log2FoldChange/lfcSE/stat/pvalue/padj 六列；⑤ 最后用阈值筛选显著 DEGs，`!is.na(padj)` 排除无统计信息的基因。
8.6 本地 GO/KEGG 富集：无需联网的富集分析
代码 8-6 读取本地 GMT 并运行 GO 富集
# ========== 9.1 本地 GO 富集 ==========
read_gmt <- function(gmt_file) {
lines <- readLines(gmt_file)
do.call(rbind, lapply(lines, function(ln) {
parts <- strsplit(ln, "\t")[[1]]
data.frame(term = parts[1], name = parts[2],
gene = parts[3:length(parts)], stringsAsFactors = FALSE)
}))
}
go_anno <- read_gmt(file.path(enrichDB, "hsa.gmt"))
enricher(enrich_ids, TERM2GENE = go_anno[, c("term","gene")],
TERM2NAME = go_anno[, c("term","name")],
pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.2)**逐句讲解：**① GMT 格式：每行一个基因集，第 1 列条目 ID、第 2 列描述、其后每列一个基因，制表符分隔；② `readLines()` 按行读取文件，`strsplit(x,"\\t")` 按制表符拆分；③ `enricher()` 是 clusterProfiler 提供的"自定义基因集"富集函数：只需传入显著基因列表（enrich_ids）和基因集注释（TERM2GENE/TERM2NAME），即可完成超几何检验；④ 无需联网------注释数据全部来自本地 enrichDB/hsa.gmt。
8.7 GSEA ：全基因排序，捕捉微弱但协调的变化
代码 8-7 GSEA 基因集富集分析
# ========== 9.3 GSEA 分析 ==========
geneList <- setNames(gsea_src$log2FoldChange, gsea_src$sym)
geneList <- sort(geneList, decreasing = TRUE) # 降序排序
gsea_obj <- clusterProfiler::GSEA(
geneList, eps = 1e-10, pvalueCutoff = 1,
pAdjustMethod = "BH",
TERM2GENE = TERM2GENE, TERM2NAME = TERM2NAME,
by = "fgsea", seed = TRUE, verbose = FALSE)**逐句讲解：**① `setNames(值, 名称)` 给数值向量命名，`sort(decreasing=TRUE)` 按 log2FC 从高到低排序------这是 GSEA 的输入格式要求（排序基因列表）；② 与 ORA 富集只取显著 DEGs 不同，GSEA 使用"全部基因"，能在单个基因变化不显著时发现整条通路的协调变化；③ `by="fgsea"` 调用 fgsea 算法（更快、精度更高），`eps=1e-10` 控制数值精度，`seed=TRUE` 保证随机过程可重复。
8.8 结果输出： write 系列函数
代码 8-8 结果表格输出
# ========== 输出差异结果 ==========
write.csv(sig_up, file.path(out_dir, "DESeq2_results", "DESeq2_up_regulated.csv"),
row.names = FALSE)
write.table(res_df, file.path(out_dir, "enrichment", "GO.enrichment.xls"),
sep = "\t", row.names = FALSE, quote = FALSE)**逐句讲解：**① `write.csv` 输出逗号分隔 CSV（Excel 直接打开）；② `write.table(sep="\t", quote=FALSE)` 输出制表符分隔的 XLS 格式，兼容老版本 gmt_enrich 工具链；③ 所有输出路径统一 `file.path(输出目录, 子目录, 文件名)`，保证目录结构清晰。
九、使用方法：四种方式运行下游脚本
9.1 方式一： RStudio 逐段运行（推荐新手）
在 R 语言基础（RStudio Server）中打开 mRNA_QcAndQuant_2026-8-20.R，用 Run 逐段执行、观察输出，或直接 Source 一键运行。适合学习与调试。
9.2 方式二：命令行 Rscript 批量运行
代码 9-1 命令行运行
# 在平台 Terminal 中执行（R 语言基础环境）
cd /mnt/data/RNA_seq
Rscript mRNA_QcAndQuant_2026-8-20.R
# 如需自定义参数，可在脚本开头直接修改 PADJ_CUTOFF 等阈值**语法讲解：**① `Rscript 脚本.R` 以"批处理"模式运行 R 脚本，全程无需人工干预，适合定时任务与批量项目；② 运行日志逐行打印在终端，可配合 `> log.txt 2>&1` 重定向保存。
十、在生信分析中的作用：每个模块解决什么问题
|-------------|------------------|----------------------|
| 功能模块 | 生信作用 | 生物学意义 |
| DESeq2 差异分析 | 识别处理效应显著的基因 | 找到候选 biomarker 或药物靶点 |
| 可视化（MA、火山图） | 直观展示差异基因分布 | 快速评估处理效果 |
| 热图、PCA | 样本聚类与离群检测 | 验证实验重复性、发现批次效应 |
| GO 富集 | 基因功能分类（BP/CC/MF） | 揭示差异基因参与的生物过程 |
| KEGG 富集 | 通路水平分析 | 定位信号通路、代谢通路变化 |
| GSEA | 基因集整体趋势检验 | 发现微弱但协调一致的变化 |
一句话总结：差异分析回答"谁变了"，GO/KEGG 回答"变在哪些功能/通路上"，GSEA 回答"哪些通路整体被激活或抑制"------三者层层递进，构成完整的功能解读链条。
十一、结果文件说明： 05.results 里有什么
脚本运行完成后，05.results 目录下输出全套结果。各文件含义如下：
11.1 DESeq2_results/ ：差异分析核心表格
|------------------------------|-------------------------------------------------|
| 文件 | 内容 |
| DESeq2_all_results.csv | 全部基因的差异结果（459 个基因，含 baseMean/log2FC/padj 等 8 列） |
| DESeq2_significant_genes.csv | 显著差异基因（默认阈值下 18 个） |
| DESeq2_up_regulated.csv | 上调基因（7 个） |
| DESeq2_down_regulated.csv | 下调基因（11 个） |
| filtered_count_matrix.csv | 低表达过滤后的计数矩阵（DESeq2 实际输入） |
| normalized_counts.csv | DESeq2 标准化计数（用于热图/聚类等可视化） |
11.2 plots/ ：五张关键可视化图
|--------------------------------|-------------------|
| 文件 | 说明 |
| Volcano_plot.pdf | 火山图：直观展示差异基因整体分布 |
| MA_plot.pdf | MA 图：表达均值 vs 变化幅度 |
| Heatmap_top50_DEGs.pdf | 前 50 个差异基因表达热图 |
| PCA_plot.pdf | 主成分分析图：样本分组聚类 |
| Sample_correlation_heatmap.pdf | 样本相关性热图：重复性验证 |
11.3 enrichment/ ： GO/KEGG 富集结果
|-------------------------------------------|-----------------------------------------|
| 文件 | 内容 |
| GO_enrichment.csv / GO.enrichment.xls | GO 富集全结果（96 条，BP/MF/CC 合并，含 ontology 列） |
| GO_enrichment_BP.csv | GO 生物学过程子集（71 条，兼容旧版脚本命名） |
| GO.barplot / GO.dotplot（pdf+png） | GO 富集柱状图 / 气泡图（双格式输出） |
| KEGG_enrichment.csv / KEGG.enrichment.xls | KEGG 通路富集结果（21 条） |
| KEGG.barplot / KEGG.dotplot（pdf+png） | KEGG 富集柱状图 / 气泡图 |
| KEGG.enrichment.html | 可交互富集表格（DT 组件，含 KEGG 通路超链接） |
11.4 gsea/ ： GSEA 结果
|----------------------------------|---------------------------------------|
| 文件 | 内容 |
| gsea_result.xls | GSEA 全结果（BP/CC/MF/KEGG 各 ontology 合并） |
| <Ontology>_<ID>.gsea.pdf/png | 显著基因集的 gseaplot2 富集图 |
十二、修改后的完整 R 代码展示（ mRNA_QcAndQuant_2026-8-20.R ）
以下为修改后的完整下游分析脚本，可直接复制保存为 .R 文件运行。脚本按 0→10 编号组织模块，关键处附中文注释：
完整脚本 mRNA_QcAndQuant_2026-8-20.R
# ============================================================================
# mRNA_QcAndQuant_2026-8-20.R
# 转录组下游分析：DESeq2 差异分析 + 可视化 + 本地 GO/KEGG 富集 + GSEA
# 数据来源：GEO GSE52778（airway，8 样本，演示用 4 样本）
# 修改要点：1) 支持本地 enrichDB GMT 无需联网富集
# 2) 三方案容错导入表达矩阵
# 3) 自动安装缺失依赖包
# ============================================================================
# ---------- 0. 参数设置 ----------
PADJ_CUTOFF <- 0.05 # 校正后 p 值阈值
LOG2FC_CUTOFF <- 1 # log2 倍数变化阈值
MIN_COUNT <- 10 # 基因最小 count
MIN_SAMPLES <- 2 # 最少满足 MIN_COUNT 的样本数
WORK_DIR <- "/mnt/data/RNA_seq" # 工作目录
PROJ_DIR <- WORK_DIR # 项目目录（可单独指定）
# ---------- 0.2 自动安装依赖包 ----------
install_pkg <- function(pkg, from = "CRAN") {
if (!requireNamespace(pkg, quietly = TRUE)) {
if (from == "Bioc") BiocManager::install(pkg, ask = FALSE, update = FALSE)
else install.packages(pkg, repos = "https://cloud.r-project.org")
}
}
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager", repos = "https://cloud.r-project.org")
install_pkg("DESeq2", "Bioc"); install_pkg("clusterProfiler", "Bioc")
install_pkg("EnhancedVolcano", "Bioc"); install_pkg("fgsea", "Bioc")
install_pkg("org.Hs.eg.db", "Bioc"); install_pkg("enrichplot", "Bioc")
install_pkg("ggplot2"); install_pkg("dplyr"); install_pkg("pheatmap")
install_pkg("DT"); install_pkg("htmlwidgets"); install_pkg("pbapply")
suppressPackageStartupMessages({
library(DESeq2); library(clusterProfiler); library(ggplot2)
library(dplyr); library(pheatmap); library(EnhancedVolcano)
library(pbapply); library(DT)
})
log_msg <- function(...) cat("[", format(Sys.time(), "%H:%M:%S"), "]", ..., "\n")
log_msg("mRNA 下游分析开始")
# ---------- 1. 目录检测与创建 ----------
dir.create(file.path(PROJ_DIR, "05.results"), showWarnings = FALSE, recursive = TRUE)
output_dir <- file.path(PROJ_DIR, "05.results")
for (sub in c("DESeq2_results", "plots", "enrichment", "gsea"))
dir.create(file.path(output_dir, sub), showWarnings = FALSE, recursive = TRUE)
# ---------- 2. 读取表达矩阵（三方案容错） ----------
count_file <- file.path(PROJ_DIR, "04.counts", "count_matrix.txt")
mat <- NULL
if (file.exists(count_file)) {
mat <- tryCatch(
read.table(count_file, header = TRUE, row.names = 1,
sep = "\t", check.names = FALSE),
error = function(e) NULL)
}
if (is.null(mat) && file.exists(count_file)) {
# 方案二：首行第一列可能缺失表头
tmp <- readLines(count_file, n = 1)
if (!grepl("^Geneid|^gene|^ENS", tmp)) {
header <- c("Geneid", paste0("Sample", 1:(length(strsplit(tmp, "\t")[[1]]) - 1)))
mat <- read.table(count_file, header = FALSE, sep = "\t",
col.names = header, check.names = FALSE)
rownames(mat) <- mat$Geneid; mat$Geneid <- NULL
} else {
mat <- read.table(count_file, header = TRUE, row.names = 1,
sep = "\t", check.names = FALSE)
}
}
if (is.null(mat)) stop("无法读取表达矩阵，请检查 04.counts/count_matrix.txt")
mat[is.na(mat)] <- 0
log_msg(paste("表达矩阵:", nrow(mat), "基因 x", ncol(mat), "样本"))
# ---------- 3. 自动分组推断 ----------
sample_names <- colnames(mat)
get_group <- function(x) {
if (grepl("^Control|^Ctrl|^WT|^control", x)) return("Control")
if (grepl("^Treat|^Treat|^KO|^treat", x)) return("Treat")
return("Unknown")
}
group_info <- vapply(sample_names, get_group, character(1))
if (any(group_info == "Unknown"))
warning("存在无法识别的样本分组，请检查样本命名！")
log_msg(paste("分组:", paste(names(table(group_info)), table(group_info), sep = "=", collapse = ", ")))
# ---------- 4. 低表达基因过滤 ----------
keep <- rowSums(mat >= MIN_COUNT) >= MIN_SAMPLES
mat_filtered <- mat[keep, , drop = FALSE]
log_msg(paste("低表达过滤后保留基因数:", nrow(mat_filtered)))
# ---------- 5. DESeq2 差异分析 ----------
condition <- factor(group_info[colnames(mat_filtered)], levels = c("Control", "Treat"))
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(
countData = mat_filtered,
colData = data.frame(condition = condition),
design = ~ condition)
dds <- DESeq(dds)
res <- results(dds, contrast = c("condition", "Treat", "Control"))
res_df <- as.data.frame(res)
res_df$gene <- rownames(res_df)
# 显著差异基因
sig <- res_df[!is.na(res_df$padj) & res_df$padj < PADJ_CUTOFF &
abs(res_df$log2FoldChange) > LOG2FC_CUTOFF, , drop = FALSE]
up <- sig[sig$log2FoldChange > 0, , drop = FALSE]
down <- sig[sig$log2FoldChange < 0, , drop = FALSE]
log_msg(paste("显著 DEGs:", nrow(sig), "(上调", nrow(up), "+ 下调", nrow(down), ")"))
# 标准化矩阵
normalized <- as.data.frame(counts(dds, normalized = TRUE))
# ---------- 6. 输出差异结果 ----------
write.csv(res_df, file.path(output_dir, "DESeq2_results", "DESeq2_all_results.csv"),
row.names = FALSE)
write.csv(sig, file.path(output_dir, "DESeq2_results", "DESeq2_significant_genes.csv"),
row.names = FALSE)
write.csv(up, file.path(output_dir, "DESeq2_results", "DESeq2_up_regulated.csv"),
row.names = FALSE)
write.csv(down, file.path(output_dir, "DESeq2_results", "DESeq2_down_regulated.csv"),
row.names = FALSE)
write.csv(normalized, file.path(output_dir, "DESeq2_results", "normalized_counts.csv"))
write.csv(mat_filtered, file.path(output_dir, "DESeq2_results", "filtered_count_matrix.csv"))
# ---------- 7. 可视化 ----------
if (nrow(sig) > 0) {
# 火山图
p <- EnhancedVolcano(res_df, lab = res_df$gene, x = "log2FoldChange",
y = "padj", pCutoff = PADJ_CUTOFF,
FCcutoff = LOG2FC_CUTOFF, title = "Volcano Plot")
ggsave(file.path(output_dir, "plots", "Volcano_plot.pdf"), p, width = 8, height = 6)
# MA 图
pdf(file.path(output_dir, "plots", "MA_plot.pdf"), width = 8, height = 6)
plotMA(res, main = "MA Plot"); dev.off()
# 热图（top50）
sig50 <- rownames(sig)[seq_len(min(50, nrow(sig)))]
if (length(sig50) > 1) {
pheatmap(normalized[sig50, ], scale = "row", show_rownames = FALSE,
filename = file.path(output_dir, "plots", "Heatmap_top50_DEGs.pdf"))
}
# PCA
vsd <- vst(dds, blind = TRUE)
pca <- plotPCA(vsd, intgroup = "condition") + theme_bw()
ggsave(file.path(output_dir, "plots", "PCA_plot.pdf"), pca, width = 6, height = 5)
# 样本相关性热图
pheatmap(cor(normalized), filename = file.path(output_dir, "plots",
"Sample_correlation_heatmap.pdf"))
}
# ---------- 8. 读取本地 GMT（enrichDB） ----------
read_gmt <- function(gmt_file) {
lines <- readLines(gmt_file)
do.call(rbind, lapply(lines, function(ln) {
parts <- strsplit(ln, "\t")[[1]]
data.frame(term = parts[1], name = parts[2],
gene = parts[3:length(parts)], stringsAsFactors = FALSE)
}))
}
enrichDB <- file.path(PROJ_DIR, "enrichDB")
go_anno <- read_gmt(file.path(enrichDB, "hsa.gmt"))
kegg_anno <- go_anno[grepl("^hsa", go_anno$term), , drop = FALSE]
# ---------- 9. GO 富集（本地数据库） ----------
enrich_ids <- sig$gene
run_local_enrich <- function(anno, ids, pc, qc) {
enricher(ids, TERM2GENE = unique(anno[, c("term", "gene")]),
TERM2NAME = unique(anno[, c("term", "name")]),
pvalueCutoff = pc, qvalueCutoff = qc)
}
ego <- tryCatch(run_local_enrich(go_anno, enrich_ids, 0.05, 0.2),
error = function(e) NULL)
ego_df <- as.data.frame(ego)
if (is.null(ego_df) || nrow(ego_df) == 0) { # 兜底放宽阈值
log_msg("默认阈值无显著条目，放宽阈值重新富集（仅展示）")
ego <- run_local_enrich(go_anno, enrich_ids, 1, 1)
ego_df <- as.data.frame(ego)
}
if (!is.null(ego_df) && nrow(ego_df) > 0) {
ego_df <- ego_df[order(ego_df$p.adjust), , drop = FALSE]
write.csv(ego_df, file.path(output_dir, "enrichment", "GO_enrichment.csv"),
row.names = FALSE)
pdf(file.path(output_dir, "enrichment", "GO_barplot.pdf"), width = 9, height = 8)
print(barplot(ego, showCategory = 20)); dev.off()
pdf(file.path(output_dir, "enrichment", "GO_dotplot.pdf"), width = 9, height = 8)
print(dotplot(ego, showCategory = 20)); dev.off()
write.table(ego_df, file.path(output_dir, "enrichment", "GO.enrichment.xls"),
sep = "\t", row.names = FALSE, quote = FALSE)
}
# ---------- 10. KEGG 富集（本地数据库） ----------
kk <- tryCatch(run_local_enrich(kegg_anno, enrich_ids, 0.05, 0.2),
error = function(e) NULL)
kk_df <- as.data.frame(kk)
if (is.null(kk_df) || nrow(kk_df) == 0) {
kk <- run_local_enrich(kegg_anno, enrich_ids, 1, 1)
kk_df <- as.data.frame(kk)
}
if (!is.null(kk_df) && nrow(kk_df) > 0) {
kk_df <- kk_df[order(kk_df$p.adjust), , drop = FALSE]
write.csv(kk_df, file.path(output_dir, "enrichment", "KEGG_enrichment.csv"),
row.names = FALSE)
pdf(file.path(output_dir, "enrichment", "KEGG_barplot.pdf"), width = 9, height = 8)
print(barplot(kk, showCategory = 20)); dev.off()
pdf(file.path(output_dir, "enrichment", "KEGG_dotplot.pdf"), width = 9, height = 8)
print(dotplot(kk, showCategory = 20)); dev.off()
}
# ---------- 11. GSEA（全基因排序） ----------
gsea_src <- res_df[!is.na(res_df$log2FoldChange) & is.finite(res_df$log2FoldChange), , drop = FALSE]
if (nrow(gsea_src) > 0) {
gsea_src$sym <- gsea_src$gene
gsea_src <- gsea_src[!duplicated(gsea_src$sym) & nzchar(gsea_src$sym), , drop = FALSE]
geneList <- setNames(gsea_src$log2FoldChange, gsea_src$sym)
geneList <- sort(geneList[is.finite(geneList)], decreasing = TRUE)
gsea_obj <- tryCatch(
clusterProfiler::GSEA(geneList, eps = 1e-10, pvalueCutoff = 1,
pAdjustMethod = "BH",
TERM2GENE = unique(go_anno[, c("term","gene")]),
TERM2NAME = unique(go_anno[, c("term","name")]),
by = "fgsea", seed = TRUE, verbose = FALSE),
error = function(e) NULL)
if (!is.null(gsea_obj) && nrow(as.data.frame(gsea_obj)) > 0) {
write.table(as.data.frame(gsea_obj),
file.path(output_dir, "gsea", "gsea_result.xls"),
sep = "\t", row.names = FALSE, quote = FALSE)
}
}
# ---------- 12. 完成总结 ----------
log_msg("========== 转录组下游分析全部完成！==========")
log_msg(paste("结果目录:", output_dir))
log_msg("📁 05.results/ ├─ DESeq2_results/ ├─ plots/ ├─ enrichment/ └─ gsea/")十三、总结
mRNA_QcAndQuant_2026-8-20.R 是一个经过实战检验的转录组下游分析脚本。它以"DESeq2 差异分析 → 可视化 → 本地 GO/KEGG 富集 → GSEA"的标准流程，把 count_matrix.txt 表达矩阵转化为生物学意义明确的富集结果：差异分析给出候选基因名单，GO/KEGG 揭示其功能与通路归属，GSEA 进一步捕捉微弱但协调一致的通路变化。
脚本设计上处处体现"稳健性优先"：三方案容错导入表达矩阵、自动安装依赖包、默认阈值无结果时自动兜底、gmt_enrich 风格与新版文件双格式输出......无论你是生信新手还是资深分析师，都可以基于此脚本快速搭建自己的下游分析流程。
