Orthologous synteny provides robust structural evidence for the ancestral angiosperm ε-WGD
共线性同源区段为被子植物祖先 ε-全基因组复制事件（ε-WGD）提供了可靠的结构证据
种子植物起源之初（ζ-全基因组复制，约 3.19 亿年前）与被子植物起源之初（ε-全基因组复制，约 1.92 亿年前）均推测发生过古老的全基因组复制事件（WGD）（Jiao 等人，2011）。然而，这些全基因组复制事件是否真实发生，长期以来一直存在争议（Ruprecht 等人，2017），这阻碍了我们理解多倍化如何推动种子植物与有花植物的演化成功。近期，Shi 与 Van de Peer（2026）基于剂量敏感基因复制本的保留模式（遵循基因剂量平衡的预期规律，Birchler 和 Veitia，2012）证实了 ζ-全基因组复制事件，但对 ε-全基因组复制事件予以否定。他们认为，定位到被子植物祖先分支上的复制信号，并不符合 ε-全基因组复制事件的预期模式。尽管该研究提供了全新的统计学视角，但本文对其数据以及更广范围的基因组证据给出了不同解读。本研究利用当前最先进的直系同源共线性分析与可识别亚基因组的系统发育基因组学方法，重新探讨 ε-全基因组复制事件，旨在为这一长期争议提供确凿的结构证据。
我们首先采用直系同源共线性分析方法（Zhang 等人，2025a）------ 该方法整合同源基因与共线性信息，用以识别物种分化产生的共线性区段 ------ 对裸子植物与被子植物基因组开展系统性比较。为获得高质量的裸子植物参考基因组，我们重新注释了银杏基因组（Liu 等人，2021）；已有研究推测银杏保留了与原始裸子植物核型高度近似的染色体排布特征（Zhang 等人，2025b），本工作将其 BUSCO 完整性由 63.5% 提升至 93.1%。尽管共线性片段已发生碎片化，但银杏与无油樟之间的直系同源共线性呈现清晰且稳定的 1:2 对应关系（图 1A）。无油樟自分化形成其余现存被子植物类群之后，未曾经历全基因组复制。具体而言，在 4520 个滑动基因窗口（窗口大小 50，步长 1）中，无油樟基因组上存在两个相互独立的同源区段，可分别匹配银杏的同一个基因组区段；但由于大规模的基因丢失分化，仅有 257 个共线性基因位点严格呈现 1:2 比例（图 1A、补充图 1、补充表 1）。全基因组范围的 1:2 共线性模式有力证明：被子植物祖先类群在与裸子植物分化之后发生过一次四倍化事件，这与前人提出的被子植物祖先 ε-全基因组复制假说吻合。该直系同源 1:2 信号在其他被子植物中同样稳定存在。未经历后续全基因组复制的物种（如马兜铃）依然保留 1:2 共线性模式；而经历过后续全基因组复制的类群则表现出更高的比例（例如瓦堡木为 1:4），与它们独立的多倍化历史相一致（图 1B、1C，补充图 2、3）。
与之形成鲜明对比，银杏与其他裸子植物基因组的比较结果稳定呈现 1:1 共线性比例（图 1B、1C，补充图 4A）。而当这些裸子植物与被子植物比较时，又普遍观测到 1:2 甚至更高的共线性比例（图 1D，补充图 4B）。这一差异化模式有力地将 ε-全基因组复制事件定位至被子植物基干演化分支。此外，尽管无油樟基因组的复制基因保留率相对较低，但基因组自比对结果依然可以检测到古老的旁系同源共线性区段（图 1E，补充图 5A），进一步为 ε-全基因组复制提供结构层面证据。
为进一步验证 ε-全基因组复制，我们将代表性被子植物基因组中的复制共线性区块划分成两个假定的亚基因组，并基于共线性分析流程开展可识别亚基因组的系统发育基因组学分析（Zhang 等人，2024）。得到的系统发育树始终将两个亚基因组解析为姐妹类群，91.9% 的单基因树均支持该拓扑结构（图 1F，补充图 6）。关键的是，两个亚基因组的分化时间发生在银杏与被子植物谱系分化之后、冠群被子植物分化之前（图 1F，补充图 6）。亚基因组系统发育与直系同源共线性模式的高度一致，提供了无可辩驳的证据：被子植物祖先基因组加倍来源于被子植物共同祖先的全基因组复制，而非更为古老的种子植物复制事件。结构证据与系统发育基因组学证据相互印证，确立了 ε-全基因组复制是被子植物演化史上一次奠基性事件（图 1G）。
共线性被公认为推断多倍化事件的金标准（Ruprecht 等人，2017；Shi 和 Van de Peer，2026），相比基因树-物种树重构、Ks 分布等基于基因的分析手段，能够提供更加直接、确凿的证据。部分研究侧重旁系同源共线性（单个基因组内部的复制信号），却忽视了直系同源共线性的重要价值（Shi 和 Van de Peer，2026）。与之不同，直系同源共线性提供一套直观、可靠且适用性广的分析框架，可用于识别多倍化事件、推断倍性水平，并将事件定位到系统发育树上（Zhang 等人，2025a）。 当旁系同源共线性信号因长期的基因丢失分化而被侵蚀时，这套比较分析方法尤为有效，无油樟基因组就是典型案例（图 1E，补充图 5A）。重要的是，尽管漫长演化过程中大规模基因丢失与染色体重排会造成共线性信号衰减，但裸子植物与被子植物之间仍然保留大量保存完好的直系同源共线性残余片段（图 1A-1D，补充图 1-4）。这种深度的结构保守性，为可靠判定 ε-全基因组复制事件是否发生及其系统发育位置提供了关键结构依据。更广泛来讲，随着染色体水平基因组组装数量快速增长，该分析策略可被大量应用，用以解析古老多倍化事件的发生时间与事件性质。
图 1 被子植物祖先 ε-全基因组复制的直系同源共线性与系统发育基因组学证据
(A) 银杏与无油樟基因组的直系同源共线性点阵图。左侧与底部坐标轴数字代表两个基因组的染色体编号；每个点代表一对共线性基因。彩色阴影高亮展示多组两基因组之间 1:2 的直系同源共线性区段。
(B) 以银杏基因组为参考，直系同源共线性深度≥2 的基因组窗口丰度。针对各代表性被子植物与裸子植物基因组，在银杏全基因组上采用滑动窗口策略计算，窗口大小设置为 20-100 个基因不等，窗口步长为 1 个基因。共线性深度 定义为：查询基因组中比对到参考基因组某一窗口的共线性区段拷贝数。
(C) 以银杏为参考，所选裸子、被子植物基因组的直系同源共线性深度（深度≥2）构成（窗口大小 = 50 个基因，步长 = 1 个基因）。右侧圆圈内数字代表基于共线性深度模式推算得到的相对于银杏（p :Gin）、相对于无油樟（p :Amb）的倍性（另见补充图 2、3、4 对应的点阵图）。
(D) 所选被子、裸子植物基因组两两互比中，直系同源共线性深度≥2 的基因组窗口占比（每个基因组作为参考时，窗口大小 = 50 个基因，步长 = 1 个基因）。每个基因组依次充当参考基因组，计算其余所有查询基因组的共线性深度。
(E) 银杏与无油樟基因组内部的旁系同源共线性深度（窗口大小 = 50 个基因，步长 = 1 个基因）。与物种间的直系同源共线性不同，旁系同源共线性检测基因组内部复制事件，排除完全自匹配的结果（另见补充图 5 点阵图）。
(F) 两个被子植物亚基因组（SG1、SG2）与银杏的系统发育重建。该树基于 234 个直系同源基因集构建，以小立碗藓与卷柏作为外类群（图中未展示）。分支节点数字为 IQTREE 计算得到的自举支持度；标尺代表每个位点 0.2 个替换。
(G) 陆地植物系统发育框架，标注已推断的全基因组复制事件位置。系统发育树以链形藻类作为外类群（未展示）。分支上不同图形代表推断得到的不同倍性的多倍化事件；绿色填充图形代表有共线性证据支持的全基因组复制；灰色填充图形为本研究依据 Shi 和 Van de Peer（2026）报道的剂量敏感复制基因保留模式得到的推测性推断。图形在分支上的位置仅为示意，属于近似标注。植物轮廓素材取自 PhyloPic（http://phylopic.org）。
Shi 与 Van de Peer（2026）的分析中，大量剂量敏感复制基因被定位到被子植物祖先分支。但他们否定 ε-全基因组复制，主要依据是观测得到的复制节点频率，不符合他们预设的被子植物-种子植物复制节点 2:1 比例（见其文章图 5）。本文认为，该预期建立在两个不够牢靠的假设之上。
第一，他们提出的 2:1 模型假定：种子植物 ζ-全基因组复制与被子植物 ε-全基因组复制均为简单的四倍化事件，即倍性仅提升 2 倍。然而，我们对银杏基因组的共线性分析检测到旁系同源共线性深度介于 2-4 之间（图 1E，补充图 5B），说明 ζ-全基因组复制对应的倍性提升幅度为 3-5 倍。该模式甚至暗示，当时发生的或许是两次连续的全基因组复制，而非单次事件。倘若 ζ-全基因组复制是六倍化（倍性提升 3 倍），那么理论预期比例就会变为 3:3（复制基因对）或 3:2（系统发育节点），他们所采用的 2:1 预期便不再成立。
第二，Shi 与 Van de Peer 假设：同一演化支内，较晚发生的全基因组复制所保留的复制基因，数量必然多于更古老的全基因组复制。该规律适用于仍处在再二倍化进程中的多倍体物种，但并不适用于早已完成再二倍化的极古老复制事件。对于这类久远的全基因组复制，复制基因的保留数量，更取决于长期基因丢失分化之后达到的稳态（Scannell 等人，2006），而不单单由事件发生时间决定。因此，很难预判哪一次古老全基因组复制会拥有更高的复制基因保留量。
尽管如此，种子植物起源带来的基因组与形态革新，其变革程度要高于后续被子植物的起源（Doyle，2013），因此 ζ-全基因组复制保留更多复制拷贝是合乎逻辑的（参考补充图 7 的假设模型）。值得注意的是，这一解读与该研究自身报道的 ζ 事件保留率（q <sub>ζ</sub>）高于 ε 事件保留率（q <sub>ε</sub>）的结果一致（见其文章图 6C）。
Shi 与 Van de Peer（2026）进一步用支系特异性同源拷贝消解模型 作为替代性解释，提出：全基因组复制之后延迟发生、且不同支系各自独立的基因丢失分化，会使得一次共同祖先的全基因组复制，在后代类群中表现为多次独立的全基因组复制信号。但该模型要求后代分支之间呈现 2:2 的直系同源映射模式（Robertson 等人，2017）。与之相悖，我们在裸子植物与被子植物之间稳定观测到 1:2（或更高）的直系同源共线性比例，和该模型不兼容。
最后，Jiao 等人（2011）的开创性工作主要依靠基于基因树的年代推算，该方法本身存在系统发育与时间估算的不确定性（Ruprecht 等人，2017）；而本文基于共线性的证据，提供了稳健的结构层面证实：ε-全基因组复制确实是所有现存有花植物共有的衍征。
尽管我们不认同 Shi 与 Van de Peer 关于 ε全基因组复制是否真实存在的结论，但本文强调他们的分析方法依然具备很高价值。在更灵活、充分考虑倍性变化的模型框架下重新解读，其实他们的数据可以为包括 ε-全基因组复制在内的古多倍化事件提供互补证据。
共线性信号会随漫长演化时间不可避免地衰减，对于陆地植物非常古老的祖先节点，共线性信号几乎完全消失。在此背景下，Shi 与 Van de Peer 的方法为检测极古老全基因组复制提供了一条重要替代路径。他们的结果（其文章图 5B、5C）已经提示，维管植物共同祖先等极深演化节点上可能存在全基因组复制事件（图 1G），而这些位置的共线性证据大多已经退化残存。
我们希望，借助共线性与系统发育基因组学联合证据平息关于 ε-全基因组复制的长期争议之后，本领域可以将研究重心转向更为古老的多倍化事件。解析陆地植物早期演化中全基因组复制的演化意义至关重要：后续的再二倍化过程，很可能催生了关键演化革新，奠定了陆地植物大规模分化的基础（Dodsworth 等人，2016；Mandákova 和 Lysak，2018；Zhang 等人，2025c；Weiss-Schneeweiss 等人，2026）。
数据收集与基因组注释
为完善本研究的基因组资源，我们对银杏（Ginkgo biloba）基因组（Liu 等人，2021）开展重新注释，将其作为主要参考基因组。从序列读取档案库（SRA）与基因组序列档案库（GSA）中共下载 1017 套 RNA‑seq 数据集。使用 minimap2 v2.30‑r1287（Li，2021）将原始读段比对至银杏基因组，再通过 StringTie v2.1.5 完成转录本组装（Pertea 等人，2015）。随后使用 EviAnn（Zimin 等人，2025）完成证据驱动型基因注释。蛋白证据采用已发表的裸子植物基因家族一致性序列（Zhang 等人，2025a）。本次重新注释得到 20 908 个高置信度蛋白编码基因；使用 BUSCO v5.3.2、embryophyta_odb10 数据库评估注释完整性（Simão 等人，2015）。
无油樟基因组采用最新发表的染色体水平版本（Carey 等人，2024）；该物种未发生独立全基因组复制，马兜铃与之情况相同（Amborella Genome Project，2013；Qin 等人，2021）。其余被子植物，基于初步分析筛选最多额外发生一次多倍化事件的代表物种。其余裸子植物选取各大主要演化支中未发生额外多倍化的代表物种（Zhang 等人，2025a）。本研究所用全部基因组来源详见补充表 2。
直系同源共线性识别与物种树构建
使用 OrthoFinder v2.3.1（参数 -M msa）推断直系同源与旁系同源基因（Emms and Kelly，2019）。借助 WGDI v0.6.2 软件的 -icl 参数，鉴定最小基因数为 5 的共线性区块（Sun 等人，2022）。利用 WGDI 的 -ks 模块计算共线性基因对的同义替换率（K <sub>S</sub>）。最后，使用 SOI v1.3.0（参数 filter‑c 0.5）整合同源基因与共线性数据，严格筛选直系同源共线性区段（Zhang 等人，2025b），保证得到的区块来源于物种分化事件，而非古老的旁系复制。
基于 OrthoFinder 输出的同源基因集，采用 SOI 系统发育基因组学流程构建物种树（Zhang 等人，2025b）。选取 1283 个单拷贝基因（允许最多 20% 物种缺失）构建串联超矩阵；使用 IQ‑TREE v2.2.0.3 构建最大似然树，设置 1000 次自举重复（Minh 等人，2020）（图 1G）。该树拓扑结构与溯祖方法 ASTRAL‑Pro v1.15.2.3 得到的结果完全一致（Zhang and Mirarab，2022）。
古多倍化事件推断
古多倍化事件主要依靠全基因组直系同源共线性模式进行推断，该方法可提供直接证据（Zhang 等人，2025b）。例如，马兜铃与无油樟之间 1:1 的直系同源共线性深度，说明二者分化之后均未发生额外全基因组复制。与之对应，瓦堡木与无油樟之间清晰的 2:1 共线性比例，证实瓦堡木支系发生过一次独立的全基因组复制（补充图 2）。为进一步验证上述推断，我们分析旁系同源共线性基因对的K <sub>S</sub>分布；若复制共线性区块对应独立的K<sub>S</sub>峰，可为全基因组复制事件提供佐证。
共线性深度能够反映多倍化或其他复制事件的发生（Tang 等人，2015）。本研究采用滑动窗口策略计算共线性深度，区别于传统的单基因共线性深度算法（Tang 等人，2015）。调用 SOI 软件的depth功能：以参考基因组为坐标系，统计覆盖参考基因组目标窗口的查询基因组区段数量，以此表征查询基因组相对于参考基因组的共线性倍增程度。沿着每条染色体扫描指定大小的滑动窗口（默认：窗口 50 个基因，步长 10 个基因）。对窗口内的参考基因，依据染色体位置与基因间距离，将查询基因组中的同源基因聚类为连续共线性区段（默认最大间隔：20 个基因）。若多个参考基因组区间发生重叠（默认最小重叠：窗口大小的 40%），则构建重叠图；图中最大连通分量的大小，即映射到同一参考区域的查询共线性区块最大数目，记为该窗口的共线性深度。直系同源共线性深度等于 1，代表查询基因组未发生独立全基因组复制；深度大于 1，则提示存在复制事件。
但片段复制等其他复制类型同样可以产生共线性信号，直系同源共线性检测也会出现假阳性，二者均会造成深度 > 1。因此，我们通过人工核对基因组内、基因组间点阵图做交叉验证，确认深度 > 1 的信号是全基因组广泛存在，而非小规模复制事件。将整体直系同源共线性深度分布人工归纳为 ** 相对倍性（p ）** 参数，代表查询基因组相对于参考基因组（或二者最近共同祖先）的倍性（Zhang 等人，2025b）。p>1 表明查询基因组在与最近共同祖先分化之后发生过独立全基因组复制。
亚基因组划分与系统发育重建
针对无油樟基因组，在 WGDI 工具辅助下参照 Zhang 等人（2024a）的方案并做少量修改，将复制共线性区块人工分配至两个亚基因组。简言之，使用 SOI 的filter模块识别直系同源共线性，而非 WGDI 的‑c参数。对于不同染色体之间亚基因组相位模糊的区域，区块随机分配至亚基因组（即相对相位）；该处理不会影响两个亚基因组姐妹关系的解析（Zhang 等人，2024a）。其余被子植物的亚基因组，利用 WGDI 的‑km功能，依据同源关系比对到无油樟基因组完成划分。通过 WGDI 的‑a参数输出共线性基因列表；即便部分基因对应无油樟两个亚基因组均存在拷贝，WGDI ‑a会自动仅保留其中一个拷贝。对于共线性已经丢失的外类群物种，提取 OrthoFinder 鉴定的同源基因，作为共线性同源基因的替代。
使用 MAFFT v7.515（Standley and Katoh，2013）与 trimAl v1.4（参数‑gappyout）（Capella‑Gutiérrez 等人，2009），对每个同源基因集开展密码子水平比对，允许最多 40% 物种 / 亚基因组缺失，最终得到 234 个基因位点。将单基因比对结果串联构建超矩阵（共 300 030 个位点），采用 IQ‑TREE、1000 次自举重复构建系统发育基因组树（图 1F）。同时使用 IQ‑TREE、1000 次自举重复构建单基因树，输入 ASTRAL‑Hybrid v1.15.2.3 构建溯祖树（Zhang 等人，2022）。最后用 PhyTop（Shang 等人，2025）可视化 ASTRAL 输出的四分树分数（q1 、q2 、q3）（补充图 6）。
DATA AND CODE AVAILABILITY
The improved gene annotations of G. biloba have been deposited into Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.31410387)