摘要
环境因素是肺动脉高压（PAH）发病的重要诱因。对苯２甲酸２(2‑乙基己基)酯（DOTP）是日常生活广泛使用的增塑剂，存在潜在健康危害。然而，长期DOTP暴露诱发肺动脉高压发生发展的分子机制尚不明确。本研究整合网络毒理学、虚拟基因敲除、分子对接以及实验验证技术，探究DOTP暴露与肺动脉高压之间关联的分子机制。 本研究筛选得到DOTP的4个核心靶点（AKT1、EGFR、KDR、SRC），并开展scTenifoldKnk虚拟敲除分析。功能富集结果表明，AKT1、EGFR、KDR可显著扰动与肺动脉内皮细胞（PAEC）损伤、迁移调控相关的信号通路。后续采用CCK‑8、LDH释放实验、RT‑qPCR、Transwell迁移实验证实：DOTP暴露可造成肺动脉内皮细胞损伤并促进细胞迁移，同时上调AKT1、EGFR、KDR的表达。最后，通过分子对接与分子动力学模拟解析DOTP与靶蛋白的相互作用以及构象变化。 本研究揭示DOTP诱导肺动脉高压发生发展的分子机制，为探究环境污染物造成肺动脉内皮细胞功能异常、诱发肺动脉高压的病理机制提供新的理论依据。
#肺动脉内皮细胞 #对苯二甲酸二酯 #DOTP #网络毒理学 #肺动脉高压
结果
DOTP潜在靶蛋白的筛选
图1 DOTP潜在靶蛋白的收集
(A) DOTP化学分子结构示意。
(B) DOTP相关靶蛋白数量统计。
肺动脉高压相关差异表达基因与共表达网络的筛选
图2 网络毒理学筛选DOTP‑肺动脉高压关键互作靶点
(A) 肺动脉高压相关靶蛋白数目。
(B) DOTP与肺动脉高压靶点的韦恩图。
(C,D) 交集靶蛋白的蛋白质‑蛋白质相互作用（PPI）网络。
(E‑G) 采用MCODE、CytoNCA、CytoHubba‑MCC算法计算高连通性子网络；颜色深浅代表权重评分。
(H) 鉴定得到6个核心靶点。
靶点功能分析与通路富集分析
图3 DOTP暴露与肺动脉高压交集靶点的富集分析
(A‑C) 交集靶点的GO功能富集分析。
(D) 交集靶点的KEGG通路富集分析。
肺动脉高压的单细胞RNA测序图谱分析
图4 肺动脉高压单细胞RNA测序图谱
(A,B) Harmony批次校正前后细胞的UMAP降维图。
(C) 全部细胞整合UMAP图，按照样本组别着色。
(D) 数据集鉴定出14种细胞类型的注释UMAP图。
(E) 细胞类型注释所用标志性基因的点图，展示各细胞类型的平均表达水平与细胞表达占比。
scTenifoldKnk虚拟敲除提示核心靶点参与肺动脉内皮细胞迁移调控
图5 核心基因虚拟敲除扰动与功能富集分析
(A‑D) 扰动排名靠前基因的热图与火山图。
(E‑G) 各基因敲除后扰动基因集的KEGG富集分析。X轴：Z得分（扰动强度）；Y轴：‑log₁₀（校正后P值）；水平虚线代表显著性阈值。
DOTP暴露诱导肺动脉内皮细胞损伤与迁移，并上调AKT1、EGFR、KDR蛋白表达水平
图6 DOTP暴露诱导肺动脉内皮细胞损伤与迁移
(A) CCK‑8实验筛选DOTP最适作用浓度（n=4）。
(B) LDH释放实验检测肺动脉内皮细胞毒性（n=4）。
(C) RT‑qPCR检测DOTP处理后肺动脉内皮细胞中TNF‑α、IL‑1β的 mRNA表达（n=6）。
(D) Western blot检测ET1、eNOS蛋白表达（n=6）。
(E) Transwell实验检测肺动脉内皮细胞迁移能力（n=6）。
(F) Western blot检测核心靶点蛋白表达（n=6）。
(G) 免疫荧光染色进一步检测核心靶点蛋白表达（n=6）；比例尺50 μm。所有数据为均值±标准差；采用单因素方差分析。NOR：常氧；HYP：缺氧。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
DOTP与核心靶点的分子对接
图7 核心靶点与DOTP分子的对接结果
(A‑C) DOTP分别结合AKT1 (A)、EGFR (B)、KDR (C)的蛋白表面图、卡通结构图、３维结合模式、２维相互作用示意。蛋白表面不同颜色代表不同蛋白结构域；２维相互作用：浅绿色‑范德华力；深绿色‑常规氢键；淡绿色‑碳‑氢键；品红色‑π‑π T型相互作用；浅品红色‑烷基相互作用与π‑烷基相互作用。
DOTP与核心靶点的分子动力学模拟
图8 DOTP与核心靶点的分子动力学模拟
(A) DOTP‑靶蛋白复合物随模拟时间变化的RMSD（均方根偏差）。
(B) DOTP‑靶蛋白复合物随模拟时间变化的Rg（回转半径）。
(C) 模拟过程中DOTP‑靶蛋白复合物3维自由能曲面分析。
(D) 蛋白氨基酸残基的RMSF（均方根涨落）。
(E) DOTP‑靶蛋白复合物埋藏溶剂可及表面积SASA动态变化。
(F) 分子动力学模拟过程中氢键形成动态。
RMSD，均方根偏差；Rg，回转半径；SASA，溶剂可及表面积；RMSF，均方根涨落。
详细总结
思维导图
研究背景
靶点筛选与核心Hub基因
scTenifoldKnk虚拟敲除结果
分子对接结果
分子动力学模拟
100 ns
体外PAEC肺动脉内皮细胞湿实验结果
研究局限性
论文明确指出
参考
Int J Mol Sci. 2026 Sep 10;27(18):8064. doi: 10.3390/ijms27188064.
Exploring the Toxicological Impacts of DOTP Exposure on Pulmonary Arterial Hypertension via Network Toxicology, Virtual Knockout, Molecular Docking and Experimental Validation
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