Integrated strategies for decoding and reconstructing pharmacologically active plant natural products biosynthesis
解析与重构药用活性植物天然产物生物合成的整合策略
要点
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具有药理活性的植物天然产物生物合成通路
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多组学与人工智能相结合的整合策略
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高效异源生产体系的构建与优化
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人工智能助力蛋白质设计与代谢工程
摘要
植物天然产物（PNP）是现代治疗药物中药理活性分子的重要来源。然而，这类物质天然丰度低、组织分布具有特异性，且结构复杂，依靠传统栽培、提取或全化学合成的方式难以实现可持续供给。近年来，多组学技术、合成生物学、蛋白质工程以及基于人工智能（AI）的设计方法快速发展，极大推动了植物天然产物生物合成通路的解析与重构。本文综述聚焦具有药理活性的萜类、生物碱和木脂素，总结了用于药物挖掘、通路解析以及在微生物与植物底盘中异源合成的整合研究策略。文中阐述了基于基因组和转录组挖掘候选基因、生物合成酶功能鉴定、关键催化酶结构与催化机制解析的相关手段；进一步梳理了实现高效异源合成的代谢工程与底盘优化策略，包括模块化通路重构、动态调控、前体与辅因子代谢重编程。本文重点介绍了新兴的蛋白质与通路 AI 设计工具，以及串联基因组挖掘、通路重构、细胞工厂适配的跨尺度研究框架，体现研究范式正从依赖自然演化向理性人工设计转变。上述进展为规模化、环境友好且经济可行的植物源药物生产奠定了基础。
1 引言
植物能够生成结构多样的天然产物，其中很多是创新药物的重要来源。临床应用效果良好的药物中，有高达 50% 来源于天然产物。部分疗效突出的抗疟疾、抗肿瘤以及抗肥胖药物均属于植物天然产物（PNP）。但在植物界中，这类植物天然产物的合成往往受到诸多制约：天然丰度低、原生物种资源稀缺，同时化学全合成难度大。
图 1 来源于植物天然产物的代表性药物及其主要治疗适应症 展示植物天然产物的化学结构、原植物物种及其药理活性。
植物天然产物结构复杂、药理价值突出，吸引了多学科交叉研究。生物合成手段已被广泛用于合成和改造具有药理活性的植物天然产物。上游生物合成通路已得到解析与优化。近年来，科研人员从药用植物中鉴定出大量下游通路酶，包括细胞色素 P450、糖基转移酶、甲基转移酶等，这类酶在植物天然产物的形成与结构多样化过程中发挥关键作用。异源合成可为传统提取方式提供可规模化的替代方案。
合成生物学的发展为植物天然产物供给模式转型提供了理论与技术支撑，推动其从依赖自然资源的传统模式转向高效、绿色、可持续的工业化生产模式。细菌与真菌中次级代谢产物的生物合成通路解析速度持续加快；来自不同物种上游通路的可利用遗传元件提供了核心工具，加快了植物天然产物异源合成平台的构建。同一类植物天然产物中，结构多样的分子往往由共同前体衍生而来，因此该领域的一大难点是导入植物来源、通路特异性基因，并平衡异源代谢通量与底盘自身内源代谢。近年来，基础代谢工程研究大量开展，已经获得大量经过优化的植物天然产物上游合成通路。在此背景下，下游限速酶的催化活性与表达水平，成为利用微生物、植物细胞工厂高效生产药用植物天然产物的核心瓶颈。
近十年来，生物合成通路解析、代谢工程技术迭代，加上人工智能赋能的快速研究体系，极大推动了复杂植物天然产物的生物合成研究。本综述选取萜类、生物碱、木脂素这几类在合成研究中取得显著进展的药用植物天然产物为对象，系统梳理其作为植物源药物的发掘历程，解析生物合成通路，并探讨在微生物与植物宿主中的异源合成策略。和以往大多只聚焦通路解析、或是单独介绍工程案例的综述不同，本文立足于整合视角，串联药物发掘、通路解析、细胞工厂优化，面向经过药理验证的植物天然产物展开论述。全文按照化合物化学类别划分章节，遵循 "药物发掘 --- 通路解析 --- 异源生产" 的研究主线，以代表性萜类、生物碱、木脂素作为案例展开。
2 具有药理与临床价值的植物天然产物及其药效
数百年来，植物一直是药物研发不可或缺的资源。阿司匹林、紫杉醇、吗啡、青蒿素等植物天然产物引领了新药开发，至今仍在炎症、肿瘤、疼痛、疟疾等重大疾病治疗中发挥重要作用。本综述聚焦通路解析与代谢工程已有大量研究积累的活性植物天然产物；按照化学类别组织内容，遵循从发掘到生产的研究脉络展开讨论。为便于梳理，依据临床转化程度和对生物合成研究的推动作用，将化合物分为三类： （1）已获批上市药物 （如紫杉醇、青蒿素、依托泊苷）：直接应用于临床； （2）临床 / 临床前候选分子 （如长春碱、加兰他敏）：已进入临床试验，或是药理活性特征明确； （3）高价值先导化合物（如雷公藤红素、鬼臼毒素）：自身复杂的生物合成通路推动了新型通路挖掘与工程改造策略的开发。 这套分类框架覆盖面广、逻辑清晰，可以同时综述领域内成熟的成功案例以及新兴技术方法。
紫杉醇（泰素）提取自太平洋红豆杉树皮，通过结合微管蛋白抑制细胞分裂，抗肿瘤效果显著。Kohei 等人对比了白蛋白结合型纳米紫杉醇（nab紫杉醇）与溶剂型紫杉醇在晚期胃癌患者中的疗效和安全性。这种新剂型无需提前使用类固醇或组胺 H2 受体拮抗剂预处理，降低了超敏反应风险；而且不含乙醇、给药浓度更高，适合酒精不耐受患者，也可用于乳腺癌、胰腺癌、胆道癌等其他实体瘤的治疗。阿替利珠单抗联合白蛋白结合型紫杉醇现已成为三阴性乳腺癌的有效治疗方案。在胰腺癌治疗中，白蛋白结合型紫杉醇联合吉西他滨的方案，还可搭配羟氯喹、卡培他滨或顺铂等药物组成多药联合疗法。
青蒿素是从黄花蒿叶片中提取的倍半萜内酯；分子内独特的过氧桥结构被裂解后可产生活性氧，是其抗疟、抗肿瘤活性的核心。近几十年，基于青蒿素的联合疗法（ACTs）大幅降低疟疾相关死亡。三联青蒿素联合疗法（如二氢青蒿素 - 哌喹 + 甲氟喹、蒿甲醚 - 本芴醇 + 阿莫地喹）对非重症恶性疟疗效好、耐受性佳。除抗疟之外，青蒿素及其衍生物对红斑狼疮、肿瘤、糖尿病同样具备生物活性。
雷公藤红素是来源于雷公藤的五环三萜，兼具抗炎、抗肿瘤、抗肥胖等多种药理活性。雷公藤红素通过结合 Nur77，抑制 TNFα 诱导的 IκBα 降解；但水溶性差（37 ℃下水溶性 13.25 ± 0.83 μg/mL）、毒性较大，限制了临床转化。它对结直肠癌、胰腺癌、胶质瘤、胃癌均表现出活性；近年研究重点关注其在肥胖与代谢综合征中的作用，它也被称作瘦素增敏剂。
大麻酚（CBN）、Δ9 - 四氢大麻酚（Δ9-THC）、大麻二酚（CBD）属于大麻植物源大麻素，在炎症、镇痛、焦虑和肿瘤治疗方面展现药理作用。许多新药先导分子的设计都受植物大麻素启发；大麻素广泛用于疼痛管理，同时具备神经保护潜力。高 CBD 提取物可降低组织模型中 ACE2 表达水平，提示其抗炎潜力。
鬼臼毒素是芳基四氢萘型木脂素，从鬼臼属植物（美洲鬼臼、桃儿七等）的根茎中分离得到。鬼臼毒素及其衍生物是一类广谱活性化合物，突出的抗肿瘤活性使其成为抗肿瘤新药研发的先导分子。临床研究证实鬼臼毒素衍生物对肺癌、肾母细胞瘤、疣状癌、非霍奇金淋巴瘤、胶质母细胞瘤、非淋巴细胞白血病等多种肿瘤有效。其半合成衍生物依托泊苷（VP-16/ETO）、替尼泊苷（VM-26）已用于肺癌、乳腺癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤的临床治疗。除此之外，鬼臼毒素及其衍生物还具有抗病毒活性，鬼臼毒素可治疗 HPV 导致的尖锐湿疣以及其他肛周、生殖器疣；同时还具备抗炎、免疫抑制、杀虫等药理活性。
绿原酸、白藜芦醇等酚酸与黄酮类物质，同样具有显著的抗氧化、抗炎与抗肿瘤活性。
综上，植物依然是新药发掘的宝贵资源，化合物活性覆盖抗肿瘤、抗炎、抗疟、神经保护等多个方向。尽管植物天然产物药用潜力巨大，但受限于合成难度高、生产成本昂贵、供给可持续性差等问题，开发进程受阻。多数植物天然产物含有多个手性中心，化学合成难度极高；从天然原料提取的方式往往成本高、环境负荷大。攻克这些瓶颈，才能推动植物天然产物在现代医学中更广泛的应用。
3 解析药用植物天然产物合成通路的整合研究策略
通路解析是天然产物研究与合成生物学应用的基础。阐明通路有助于理解分子机制，同时支撑底盘细胞的理性改造。核心手段包含候选基因筛选、基因功能鉴定、酶结构与催化机制解析。
3.1 候选基因筛选
候选基因筛选是通路解析的前提。生物信息学与功能基因组学可以识别编码酶的基因。雷公藤、黄连、黄花蒿、红豆杉等物种的基因组测序，为通路基因挖掘提供基础；转录组可检测基因表达、发掘新基因，是基因组数据的重要补充；代谢组用于分析代谢物分布，识别通路中间产物。基因组、转录组、代谢组联合的多组学策略，可筛选药用植物天然产物合成通路中的相关基因，还能解析生物合成基因簇（BGC）的多样性、定位与演化规律。参与特定代谢物合成的基因，通常和对应代谢物积累存在共表达、相关性，研究者可通过关联分析绘制转录组 - 代谢组全局关联图谱。
全基因组关联分析（GWAS）用于挖掘遗传位点和性状之间的关联。将候选基因和功能已知的同源基因开展系统发育聚类分析，可以定位代谢性状相关位点编码的生化功能蛋白或蛋白复合体，辅助候选基因筛选。基于代谢物的全基因组关联分析（mGWAS）最早在模式植物拟南芥中应用，现已拓展至多个物种。利用 GWAS 解析自然群体代谢变异，有助于通路重构、优先锁定目标基因。
总而言之，筛选方案需要根据现有研究资源选择：已有参考基因组的物种，生物合成基因簇挖掘、GWAS 是高效的候选基因筛选手段；非模式植物中，深度转录组结合代谢组，仍是最容易落地、有效的初步研究方案。
3.2 功能基因验证
基因功能验证常用手段包括同位素示踪饲喂、体外酶活实验、植物体内验证、异源表达、基因敲除；植物组织基因编辑是功能研究的常用方法。CRISPR/Cas 系统依靠 DNA 结合结构域与核酸酶结构域发挥作用。Tian 等人将 CRISPR/Cas9 应用于模式药用植物丹参，使用 170 条 sgRNA 靶向 121 个基因，构建大规模突变体库，获得 1664 个纯合或双等位基因突变株。同位素标记是另一种功能鉴定手段：Li 等人结合底物饲喂、²H/¹⁸O 同位素标记以及密度泛函理论计算，解析了环氧合酶 TmCYP1 催化紫杉醇四环骨架内氧杂环形成的反应机制。原核与真核表达系统广泛用于功能验证，大肠杆菌、酿酒酵母是代表性体系，用于候选酶的活性检测；本氏烟草等植物表达系统也常用于基因功能表征。Hong 等人在本氏烟草中，以上游中间体为底物，成功重构了西地那非、马钱子碱、地贝他宁的生物合成通路。
一套成熟的验证流程一般包含：体外酶活确认催化活性、异源表达快速初筛、CRISPR/Cas9 获得植物体内遗传证据。
3.3 关键酶蛋白结构与催化机制解析
蛋白结构解析主要依靠 X 射线晶体学与冷冻电镜（cryo-EM），以此揭示催化机制与分子相互作用。Ma 等人借助 X 射线晶体学与冷冻电镜，解析耐旱植物来源的烯丙基焦磷酸合酶 OsCyc1 的不同寡聚状态，包括底物 GGPP 结合的 OsCyc1-D367A 突变体冷冻电镜结构。Tong 等人解析了丹参 SmMDS 蛋白游离态、结合 GGPP 状态下的晶体结构。Luo 等人报道了首个雷公藤氧化鲨烯环化酶 TwOSC 的冷冻电镜结构。
图 2 药用植物天然产物生物合成通路解析整合技术路线，包含三大核心研究模块：基于多组学与全基因组关联分析筛选目标基因；通过体外酶活、异源表达、CRISPR-Cas9 编辑开展基因功能鉴定；结合结构生物学实验、AI 蛋白预测以及量子力学 / 分子力学（QM/MM）计算化学，解析酶结构与催化机制。
近年来，人工智能推动蛋白质结构预测技术取得巨大进展。科研人员开发出可依据氨基酸序列预测蛋白结构的计算方法，DeepMind 开发的 AlphaFold 是其中代表性 AI 工具。AlphaFold 3 的预测能力进一步拓展，可预测蛋白 - 配体复合物以及蛋白与核酸（DNA/RNA）的相互作用。华盛顿大学 Baker 团队开发的 RoseTTAFold 依托深度神经网络与共进化耦合分析，能够高精度预测蛋白质三级结构。RoseTTAFold 建模速度快，在蛋白质组水平研究以及基于结构的药物设计中不可或缺。
计算化学是解析酶催化机制的重要工具，其中量子力学 - 分子力学混合模拟（QM/MM）已经成为研究凝聚相酶促反应的主流手段。定点突变常用来鉴定催化关键残基。例如，氧化鲨烯环化酶（OSC）能够催化 (3S)-2,3 - 氧化鲨烯环化，生成结构多样的五环三萜骨架，是自然界最复杂的酶促转化反应之一。Luo 等人利用 QM/MM 自由能计算绘制催化构象响应（CSR）能量图谱，锁定决定五环三萜骨架类型的关键氨基酸残基；并以此对半理性设计得到两个 TwOSC 突变体，分别大幅提升木栓酮与 β- 香树脂醇的产量。
依托 AI 结构生物学开展酶的理性改造已有诸多案例，上述 OSC 突变体、甲基转移酶的定向改造就是典型代表。
植物天然产物生物合成研究搭建起一套从基因挖掘到通路设计的完整体系，涵盖基因鉴定、功能验证、机制解析，最终实现代谢通路的人工重构与优化。骨架合成通路解析完成后，当前研究最大难点集中在后修饰网络。萜类的结构多样性，来源于环化酶对共同前体的精准催化以及碳正离子中间体的复杂重排；生物碱含氮杂环的形成，则依赖氨基酸衍生通路中精细的官能团转化与环化反应。这类复杂结构的合成，一般需要有序的系列修饰反应，包括氧化、糖基化、甲基化、酰基化、异戊二烯化。 该方向一大瓶颈是精准识别修饰网络中的中间体、确定修饰先后顺序。多组学联合分析与功能基因组学虽然可以高效筛选候选修饰酶，但中间体鉴定与反应顺序判断依然十分困难。化学合成结合同位素标记，可以追踪标记底物的转化过程，直接证实底物与产物的对应关系；对大规模代谢组数据做统计分析，对比修饰特征与丰度分布，能够推断反应顺序 ------ 通路上游中间体通常积累量更高。在异源表达体系中依次导入候选修饰酶，分析新生成的代谢物，可帮助鉴定中间体，同时明确酶的功能及其在通路中的位置。
综上，整合多组学、功能基因组学、结构生物学与 AI 辅助计算建模，能够解析药用活性植物天然产物的生物合成通路及其调控网络。这套整合策略不仅深化我们对植物特化代谢的理论认知，还可以挖掘通路中的关键酶、调控节点与限速步骤，为完整通路重构、中间反应解析、不同类别天然产物的通路架构对比奠定基础。后续章节将围绕代表性药用萜类、生物碱、木脂素的生物合成展开，重点介绍其关键基因、酶与中间体的解析历程。
4 药用萜类、生物碱与木脂素的生物合成
植物天然产物在医药、食品、化妆品等多个行业都具有重要价值。传统获取方式是从植物材料中提取。但天然植株中目标化合物含量低、原植物生长缓慢，供给受限，制约其临床广泛应用。例如，红豆杉树皮中紫杉醇含量仅 0.004%--0.01%；雷公藤根中雷公藤甲素占干重比例为 0.001%--0.01%。传统种植模式消耗大量土地与植物资源，资源消耗大，难以持续。 为解决上述难题，越来越多研究聚焦解析天然产物生物合成通路，借助合成生物学改造微生物细胞工厂来生产目标产物。该方案可以突破自然资源限制，降低对原植物的依赖；以微生物作为生产底盘，便于放大生产、提升产量，实现高价值天然产物的可持续供给。通路解析是一切工作的基础：弄清化合物合成涉及的分子机制与酶促步骤，才能理性改造菌株，实现高滴度合成；同时支撑开发更高效、绿色的规模化生物技术生产方案，减少植物提取带来的环境负担。总而言之，通路工程是释放植物天然产物药用潜力、推动临床应用、减轻野生植物资源压力的核心手段。
4.1 药用萜类的生物合成
萜类是由 C5 异戊二烯单元构成的一大类化合物，生物活性丰富。萜环化酶分为 I 型与 II 型，催化异戊二烯底物经由碳正离子机制发生环化；氧化鲨烯环化酶（OSC）负责生成多样的三萜骨架。下游修饰酶，如 P450、酰基转移酶、糖基转移酶等，进一步对萜母核进行修饰改造。
4.1.1 倍半萜
倍半萜（C15）由 3 个异戊二烯单元组成，骨架类型丰富，包含无环与环状结构。多数倍半萜常温下为液态，主要存在于植物挥发油中；醇、酮、内酯等含氧衍生物也普遍存在于挥发油内。
药用植物黄花蒿是倍半萜青蒿素的主要来源，青蒿素是抗疟核心药物。青蒿素属于高度氧化的倍半萜，独特的 1,2,4 - 三恶烷环是发挥抗疟活性的关键结构。黄花蒿隶属于菊科，青蒿素主要积累于花与叶片，合成通路属于类异戊二烯途径，过程复杂。青蒿素合成依托 MEP 与 MVA 通路生成前体 FPP；FPP 在 ADS 催化下环化，再经 CYP71AV1 氧化生成青蒿酸。青蒿酸向青蒿素转化有两条路径：一条经 DBR2/ALDH1 催化生成二氢青蒿酸，另一条为光氧化途径。
4.1.2 二萜
二萜由 4 个异戊二烯单元构成，共 20 个碳原子。线性、单环二萜在植物中相对少见，绝大多数为双环、三环二萜，含氧二萜尤为多见。 紫杉醇是从珍稀红豆杉属植物中分离得到的四环二萜，解析紫杉醇合成通路是解决其供给难题的关键。紫杉醇合成通路共包含约 19 步反应，部分转化机制仍有待完整解析。整条通路分为三部分：第一步合成紫杉烷四环二萜核心骨架，生成巴卡亭 III；第二步合成 β- 苯丙氨酰辅酶 A 侧链；第三步将侧链连接至巴卡亭 III，再经多步修饰得到紫杉醇。
高质量红豆杉基因组加速了通路解析；研究者通过异源重构鉴定到巴卡亭 III 合成关键基因。2024 年，Kampranis 团队报道 CYP725A4 催化外紫杉二烯、内紫杉二烯环氧化，生成带有氧杂环的 4 - 羟基 - 5,20 - 环氧紫杉烷，说明紫杉醇氧杂环的形成发生在 C5 乙酰化之前，同时提示紫杉醇存在多条合成分支通路。同年，科研人员找到紫杉醇通路中两个长期缺失的关键酶 T9αH 和 TOT；在烟草中共表达 TOT、T9αH 以及另外 7 个已知合成基因，成功检测到巴卡亭 III，阐明紫杉烷氧杂环这个关键结构的形成机制，补齐紫杉醇合成通路。戴均贵团队从稳定产紫杉醇的曼地亚红豆杉愈伤组织中鉴定并功能表征氧杂环合酶 TmCYP1，证实该 P450 负责催化紫杉醇氧杂环的生成，系统解析其催化机制；江会锋团队解析 CYP725A4 催化紫杉二烯重排生成紫杉二烯 - 5α- 醇的酶促机理，阐明紫杉二烯与异紫杉二烯的氧化机制。以上系列研究极大推动紫杉醇通路解析。综上，紫杉醇生物合成通路的解析，为规模化生产奠定基础，也为其他紫杉烷类天然产物的通路研究提供理论参考。
4.1.3 三萜
雷公藤红素是从雷公藤中分离得到的活性物质，具有良好的抗肿瘤、抗肥胖活性。雷公藤中天然含量极低，异源重构其合成通路是高效获取该化合物及其非天然衍生物的重要方向，但目前仅部分通路被解析。 2021 年，研究者从雷公藤中鉴定出细胞色素 P450 单加氧酶 TwCYP712K1，该酶在雷公藤红素通路中催化木栓酮三步氧化生成扁蒴藤素。底物饲喂与体外酶活实验进一步证实 ThCYP712K1 在 C-29 位点氧化木栓酮，生成扁蒴藤素。研究者通过基因组整合内源通路基因的策略，构建多株工程菌株；导入高活性突变体 TwOSC1T502E 后，所有整合菌株（tHMG1、ERG1、ERG20、ERG9、POS5、UPC2.1）的红没药烯产量相比 BY4741 菌株提升 3.0--6.8 倍。 2024 年另一项研究发现 CYP716 家族酶 TwCYP716C52 可氧化雷公藤红素前体扁蒴藤素的 C-2 位，生成南蛇藤酸 C；在雷公藤悬浮细胞中 RNA 干扰抑制 TwCYP716C52 表达，进一步验证它参与雷公藤红素合成。同年，刘长利团队鉴定 P450 酶 TwCYP82AS1，负责雷公藤内酯甲合成过程的 C-22 羟基化；同时发现 TwCYP712K1~K3 除作用于木栓烷型三萜外，还可对齐墩果烷型三萜的 C-29 位点进一步氧化羧化。雷公藤红素通路的解析，为后续挖掘新功能酶提供候选基因线索与充足前体。
图 3 药用三萜的生物合成通路 Acetyl-CoA：乙酰辅酶 A；AACT：乙酰乙酰辅酶 A 硫解酶；HMGS：3 - 羟基 - 3 - 甲基戊二酰辅酶 A 合酶；HMG-CoA：3 - 羟基 - 3 - 甲基戊二酰辅酶 A；HMGR：3 - 羟基 - 3 - 甲基戊二酰辅酶 A 还原酶；MVA：甲羟戊酸；MVK：甲羟戊酸激酶；PMK：磷酸甲羟戊酸激酶；MVD：甲羟戊酸二磷酸脱羧酶；G3P：3 - 磷酸甘油醛；DXS：1 - 脱氧 - D - 木酮糖 - 5 - 磷酸合酶；DXP：1 - 脱氧 - D - 木酮糖 - 5 - 磷酸；DXR：1 - 脱氧 - D - 木酮糖 - 5 - 磷酸还原异构酶；MEP：2-C - 甲基 - D - 赤藓醇 - 4 - 磷酸；MCT：2-C - 甲基 - D - 赤藓醇 - 4 - 磷酸胞苷酰转移酶；CDP-ME：4-(胞苷 5'- 二磷酸)-2-C - 甲基 - D - 赤藓醇；CMK：4-(胞苷 5'- 二磷酸)-2-C - 甲基 - D - 赤藓醇激酶；CDP-ME2P：4-(胞苷 5'- 二磷酸)-2-C - 甲基 - D - 赤藓醇 2 - 磷酸；MDS：2-C - 甲基 - D - 赤藓醇 2,4 - 环二磷酸合酶；MECDP：2-C - 甲基 - D - 赤藓醇 2,4 - 环二磷酸；HDS：(E)-4 - 羟基 - 3 - 甲基丁 - 2 - 烯基二磷酸合酶；HMBPP：(E)-4 - 羟基 - 3 - 甲基丁 - 2 - 烯基二磷酸；HDR：(E)-4 - 羟基 - 3 - 甲基丁 - 2 - 烯基二磷酸还原酶；IPP：异戊烯焦磷酸；IDI：异戊烯焦磷酸异构酶；DMAPP：二甲基烯丙基焦磷酸；ADS：紫穗槐二烯合酶；CYP71AV1：细胞色素 P450 单加氧酶 71AV1；DBR2：青蒿醛 Δ11 (13) 双键还原酶 2；ALDH1：青蒿醛脱氢酶 1；OSC：氧化鲨烯环化酶；TS：紫杉二烯合酶；T5H：紫杉二烯 - 5α- 羟化酶；T13H：紫杉烷 - 13α- 羟化酶；TAT：紫杉烷 - 2α-O - 苯甲酰基转移酶；T2H：紫杉烷 - 2α- 羟化酶；T7H：紫杉烷 - 7β- 羟化酶。
总体而言，萜类生物合成的主线（从 IPP 与 DMAPP 生成，到萜环化以及后续骨架修饰）已经相对清晰。这些研究进展推动了利用合成生物学对萜类进行高效异源合成。尽管如此，该领域仍面临诸多挑战：很多药用萜类，尤其是碳骨架特殊、重排程度高的萜类，负责构建核心骨架的萜合酶尚未被鉴定，或是催化机制研究尚不充分。与此同时，大量下游修饰酶的功能归属仍不明确，多数萜类家族后期的氧化、还原与共轭修饰步骤有待解析。攻克这些难题是后续研究的核心目标。
4.2 药用生物碱的生物合成
生物碱是一类含氮次级代谢产物，结构复杂、药理活性突出。生物碱以氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、鸟氨酸）为前体合成，主要分为异喹啉类、吲哚类、托品烷类生物碱。
4.2.1 苄基异喹啉生物碱（BIA）
苄基异喹啉生物碱（BIA）起源于酪氨酸，经去甲乌药碱合酶（NCS）催化多巴胺与 4 - 羟基苯乙醛发生 Pictet--Spengler 缩合反应，生成 (S)- 去甲乌药碱。后续经过甲基化、羟基化修饰，(S)- 去甲乌药碱转化为 (S)- 网脉番荔枝碱（(S)- 瑞枯灵），它是吗啡、小檗碱以及其他苄基异喹啉生物碱合成的关键分支中间体。后续研究需要系统鉴定延胡索、罂粟等多种产苄基异喹啉生物碱植物中的 OMT（氧甲基转移酶）、NMT（氮甲基转移酶）与 CYP450，解析其底物宽泛性与催化机制，为改造微生物细胞工厂、规模化合成苄基异喹啉生物碱奠定基础。
吗啡类生物碱（包括蒂巴因、可待因、吗啡、奥利巴因）仅在罂粟及其近缘物种中合成。罂粟中吗啡类生物碱以 (S)- 网脉番荔枝碱为前体，经 PsSTORR 催化异构化为 (R)- 网脉番荔枝碱，再依次由 CYP719B1、SalR、SalAT、THS 催化生成蒂巴因。蒂巴因在 T6ODM、NISO、COR 的催化下生成可待因；也可经由 CODM、T6ODM、COR 转化为吗啡。上述合成基因在基因组上成簇分布。该发现推翻了以往自发异构的传统假说，证实可待因酮的生成依赖酶促反应。
小檗碱的合成始于 (S)- 网脉番荔枝碱：BBE 将其转化为 (S)- 金黄紫堇碱，随后经 9OMT 甲基化、CYP719A 催化形成亚甲二氧基桥，得到 (S)- 加拿定，最后由 THBO 氧化生成小檗碱。另一分支通路依靠 CFS、SPS、STOX 合成苯并菲啶类生物碱；基因簇扩增提升了酶的催化多样性。这套精密的酶促网络展示了保守酶系统如何通过功能分化、基因簇优化，演化出合成复杂植物代谢物的能力。
原阿片碱与血根碱以 (S)- 刺罂粟碱为前体，先经 TNMT 催化 N - 甲基化，再由 MSH（CYP82N4）开环得到原阿片碱；之后经 P6H（CYP82N3）催化生成二氢血根碱，再由 DBOX 氧化形成血根碱。另一分支以 (S)-N - 甲基加拿定为底物，生成白屈菜红碱。这种代谢可塑性体现了酶促反应的多功能性以及调控网络的复杂性。
图 4 (S)- 瑞枯灵、罂粟碱、吗啡、小檗碱、原阿片碱类、血根碱与那可丁的生物合成通路 6OMT：6-O - 甲基转移酶；3'OMT：3'-O - 甲基转移酶；NdeMT：去甲乌药碱 N - 甲基转移酶；DBOX：二氢血根碱氧化酶；CODM：可待因 O - 去甲基酶；T6ODM：蒂巴因 6-O - 去甲基酶；NISO：新吗啡酮异构酶；COR：可待因酮还原酶；BBE：小檗碱桥酶；BBEL：BBE 类似酶；9OMT：9-O - 甲基转移酶；STOX：刺罂粟碱氧化酶；TNMT：四氢小檗碱顺式 - N - 甲基转移酶；MSH：芒廷酮合酶；P6H：原阿片碱 6 - 羟化酶；AT1：13-O - 乙酰基转移酶；PsOMT2：罂粟 O - 甲基转移酶 2；PsOMT3：罂粟 O - 甲基转移酶 3；CXE1：羧酸酯酶 1；SDR1：短链脱氢酶 / 还原酶。
那可丁以 (S)- 金黄紫堇碱为前体，依次经 PsOMT1、CYP719A1 与 TNMT 催化，生成 (S)-N - 甲基加拿定；再由 PsCYP82Y1、PsCYP82X2 催化羟基化，之后在 PsAT1、PsOMT2/3、PsCXE1、PsSDR1 的作用下完成乙酰化、甲基化以及后续水解 / 脱氢反应，最终生成那可丁。
4.2.2 萜类吲哚生物碱（TIA）
萜类吲哚生物碱以色氨酸和裂环马钱子苷为前体合成。色氨酸脱羧酶（TDC）催化色氨酸生成色胺；色胺在异胡豆苷合酶（STR）催化下与裂环马钱子苷缩合，生成异胡豆苷；异胡豆苷经 SGD 脱糖后生成高活性中间体，再经由多条分支通路生成各类萜类吲哚生物碱，是下游代谢多样化的关键分支节点。
抗心律失常药阿吗灵由共同前体异胡豆苷合成：异胡豆苷先脱糖、重排、环化得到脱氢异喜果苷，再依次经 SB（沙帕甘桥合酶）、PNAE、VS（维诺林合酶）、VH（P450 羟化酶）、VR、DHVR、AAE 和 NMT 催化生成阿吗灵。马钱苷转化为裂环马钱子苷是潜在限速步骤，提示过表达裂环马钱子苷合酶有助于提升阿吗灵产量。
长春碱是来源于长春花的强效抗癌生物碱，由文多灵和长春质碱二聚生成。文多灵由它波宁经 T16H、HOMT、NMT、D4H、DAT 催化合成；长春质碱经由脱氢赛可定中间体生成。过氧化物酶 CRPRX1 催化长春质碱与文多灵偶联，脱水生成脱水长春碱，后者再经羟基化得到长春碱。该酶定位于液泡，是吲哚生物碱合成中的关键限速酶。脱水长春碱羟基化生成长春碱，长春碱再经 N - 甲基氧化得到长春新碱。
图 5 阿吗灵、长春碱与士的宁的生物合成通路 TDC：芳香氨基酸脱羧酶；STR：异胡豆苷合酶；SGD：异胡豆苷 β葡萄糖苷酶；SB：沙帕甘桥合酶；PNAE：多神经氨酸醛酯酶；VS：维诺林合酶；VH：P450 羟化酶；VR：沃米雷宁还原酶；DHVR：1,2二氢沃米雷宁还原酶；AAE：乙酰酯酶；NMT：N甲基转移酶；CS：香茅醛合酶；T16H：它波宁16羟化酶；HOMT：16羟基它波宁O甲基转移酶；D4H：去乙酰文多灵4羟化酶；DAT：去乙酰文多灵4O乙酰转移酶；CRPRX1：脱水长春碱合酶；SnvGO：细胞色素 P450 酶；SnvNS1：α/β 水解酶；SnvNO：羟化酶；SnvWS：中链脱氢酶；SnvAT：BAHD 家族酰基转移酶。
士的宁是马钱科植物来源的吲哚生物碱。其生物合成以喜果苷为前体，经 SnvGO（CYP71AY6）、SnvNS1、SnvNO（CYP71A144）、SnvWS 催化生成维兰德古姆利希醛，最后由 SnvAT 催化转化得到士的宁。
4.2.3 托品烷生物碱及其他生物碱
托品烷生物碱拥有8氮杂双环 3.2.1 辛烷核心骨架。东莨菪碱的生物合成起始于鸟氨酸 / 精氨酸脱羧生成腐胺，再依次经 PMT、MPO、PYKS 与 CYP82M3 催化生成托品酮。托品酮被 TRI 还原为托品，托品经 UGT1、LS 与苯乳酸发生偶联反应生成莨菪品碱；CYP80F1 与 HDH 将莨菪品碱转化为莨菪碱，莨菪碱再由 H6H 完成羟基化与环氧化，最终生成东莨菪碱。
石杉碱甲是乙酰胆碱酯酶抑制剂，用于阿尔茨海默病治疗。它以赖氨酸为前体，经 LDC、CAO、III 型聚酮合酶（PKSIII）生成石榴碱；之后由 BBE 类似酶催化环化，再经 CYP450 或 2酮戊二酸依赖双加氧酶（2OGD）进行氧化修饰，得到石杉碱甲。Fe (II)/2OGD 酶在通路后期的羟基化、环化反应中起到关键作用。
加兰他敏属于四环异喹啉类生物碱，以苯丙氨酸和酪氨酸为合成前体。苯丙氨酸经 PAL 催化生成原儿茶醛；酪氨酸在 TYDC 作用下脱羧生成酪胺。二者缩合、还原生成降孤挺花定；降孤挺花定经 N4OMT 甲基化，再由 CYP96T 发生氧化偶联，构建二苯并呋喃骨架。该关键步骤通过对位邻位偶联模式形成加兰他敏的 A/B 环体系，生成中间体 N去甲基那维定；后续再经过甲基化、还原反应，完成加兰他敏的生物合成。
图 6 东莨菪碱、石杉碱甲与加兰他敏的生物合成通路 ArAT4：芳香氨基酸转氨酶 4；UGT1：UDP葡萄糖基转移酶；ADC：胍丁胺脱羧酶；ODC：鸟氨酸脱羧酶；PMT：腐胺 N甲基转移酶；MPO：N甲基腐胺氧化酶；PYKS：非典型 III 型聚酮合酶；TRI：托品酮还原酶 I；LS：丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶；HDH：醛脱氢酶；H6H：双功能 2酮戊二酸依赖型酶；LDC：赖氨酸脱羧酶；CAO：铜胺氧化酶；PKS：聚酮合酶。
尽管许多生物碱的药用价值已经得到充分证实，但它们的生物合成通路，尤其是骨架形成步骤，在很大程度上仍未阐明。目前对通路后期修饰反应的认知逐步完善，然而负责早期碳碳键（CC）、碳氮键（CN）生成的酶仍未被发现。该领域的后续进展需要综合运用多组学数据、优化代谢工程策略以及先进的异源表达体系，让复杂生物碱能够更好地服务于药物研发。
4.3 药用木脂素的生物合成
4.3.1 药用木脂素及其生物活性
木脂素属于 C6C3C3C6 型天然产物，结构类型丰富，具备抗肿瘤、抗炎、神经保护等多种生物活性。鬼臼毒素的衍生物依托泊苷与替尼泊苷已获批上市；作为细胞毒性药物，主要用于治疗小细胞肺癌、恶性淋巴瘤、急性白血病、膀胱癌、前列腺癌、胃癌等疾病。联苯双酯与双环醇属于二苄基丁内酯类化学合成中间体，拥有优异的肝脏保护活性，已获批上市，用于治疗慢性肝炎以及丙氨酸氨基转移酶持续异常。
图 7 木脂素及其衍生药物的结构分类
4.3.2 植物中药用木脂素的生物合成通路
从苯丙氨酸生成松柏醇这一段的鬼臼毒素生物合成通路已经研究得比较清楚。鬼臼毒素下游通路起始于两分子松柏醇在 DIR（ dirigent，定向蛋白）的作用下发生二聚反应，生成 (+)松脂醇；随后经 PLR 催化开环，生成 (+)落叶松脂醇与 (−)开环异落叶松脂醇。之后，在依赖 NADPH 的 SDH 酶催化下，美落叶松脂素被加氢还原，生成 (−)罗汉松脂素。再经 CYP719A23 催化，生成带有亚甲二氧基桥的 (−)雨石蒜木脂素。继而依次由 CYP71CU1、CYP71BE54、CYP82D61、OMT3、OMT1、DPS 催化，完成鬼臼毒素四环核心骨架的构建。
另外，依托泊苷的化学合成相关研究发现，拟南芥来源的 UGT78D2 可对依托泊苷前体 DMEP 的 4OβD吡喃葡萄糖苷 (−)GDMEP 进行糖基化修饰，实现依托泊苷的制备。但是，鬼臼毒素 C4 位引入 α羟基的分子机制尚不明确；而 C4 位上引入 β羟基生成 (−)表鬼臼毒素这一步，已证实由 CYP82D61 和 CYP3A4 共同催化。
图 8 药用木脂素的生物合成通路 DIR：定向蛋白；PLR：松脂醇落叶松脂素还原酶；CFAT：肉桂醇酰基转移酶。
菘蓝中，IiDIR1/2 与 IiPLR1 介导木脂素的立体选择性合成，多种 UGT 酶负责催化糖基化修饰。联苯环辛烯型木脂素拥有八元环骨架，目前其生物合成通路研究还较为匮乏。强等人报道了松柏醇酰基转移酶（CFAT）与异丁子香酚合酶（IGS），二者分别催化松柏醇的酰化与脱酰化反应。刘等人系统鉴定并验证了联苯环辛烯型木脂素（DBCOD）生物合成通路中的五步酶促反应；其中包括前戈米辛（二苄基丁烷型木脂素）苯环之间的碳碳偶联，生成联苯环辛烯型木脂素戈米辛 J，完成五味子联苯环辛烯木脂素八元环核心骨架构建的关键步骤。但梅泽等人 2007 年推测的联苯环辛烯型木脂素完整生物合成通路，仍有待更多基因挖掘与功能验证加以证实。
木脂素生物合成起始于苯丙烷类前体，由定向蛋白介导立体选择性二聚。解析细胞色素 P450 酶与定向蛋白如何调控区域选择性、立体选择性偶联反应，是完整解析木脂素合成通路的核心。与此同时，大量负责特征糖基化修饰的 UDP糖基转移酶（UGT）尚未被鉴定，而糖基化对化合物的溶解性、稳定性与药理活性影响显著。攻克上述研究缺口，解决骨架组装、精准糖基化相关的合成生物学难题，是构建高效异源生产体系、实现药用木脂素理性生物改造的关键。
萜类、生物碱与木脂素均起源于初级代谢，但三者在前体来源、通路架构、主导酶类方面差异显著，因此异源生产的难易程度也各不相同。 萜类以通用异戊二烯前体 IPP、DMAPP 为合成原料；甲羟戊酸（MVA）与 MEP 两条通路在几乎所有微生物底盘中都固有存在，可通过少数成熟改造手段强化前体供给（例如过表达tHMG1 、下调ERG9/ERG7）。萜类骨架多样性主要由可溶性的萜合酶、氧化鲨烯环化酶产生，这类酶在大肠杆菌与酵母中大多表达良好；但下游修饰主要依靠膜结合型细胞色素 P450，因此酵母成为首选底盘。目前三者之中，萜类可实现最高发酵滴度（例如青蒿酸 25 g/L，紫杉二烯 1 g/L），现存主要难点在于解析通路后期修饰步骤。
生物碱以芳香氨基酸为前体，单个骨架对应的结构复杂度最高；通路通常包含 PictetSpengler 缩合、立体构型翻转（如 STORR 蛋白）、酚类碳碳偶联、N甲基化等反应，合成基因常成基因簇排布。多数骨架合成酶为植物特有，大量反应步骤尚未解析；已实现重构的体系（长春碱、血根碱、东莨菪碱）均需要大量 P450 与还原酶的功能性表达，几乎只能选用酿酒酵母或本氏烟草作为底盘。已报道的产物滴度比萜类低 23 个数量级；中间体不稳定、细胞毒性大（如异胡豆苷苷元、脱氢赛可定）是反复出现的技术瓶颈。
木脂素处于二者中间水平：前体松柏醇来自苯丙烷通路，酵母、植物具备该通路，大肠杆菌没有，因此需要完整移植通路。木脂素通路相对较短，核心酶为定向蛋白、松脂醇落叶松脂素还原酶（PLR）、P450 以及 UGT，立体选择性偶联是决定产物特异性的关键。但受苯丙烷类酶底物混杂性、下游糖基化实现难度的限制，产物滴度仅处在毫克每升到克每升的水平。
通过以上对比，可以得到具备通用性的启示： （1）如萜类那样，底盘生物本身就具备的保守前体通路，能够极大降低微生物异源生产的技术门槛； （2）P450、O甲基转移酶、UGT 为三类物质共用酶家族，可以共用改造策略，例如氧化还原伴侣平衡、亚细胞区室化改造、骨架辅助蛋白； （3）对于存在不稳定中间体、依赖植物特有细胞器的通路，植物底盘或是模拟细胞间代谢分工的酵母共培养体系，是当前最可行的方案。
Table 1. Representative PNPs: heterologous biosynthetic pathway elucidation, key engineering strategies, chassis, and reported titers.
|----------------------------------------------------|------------------------------|-------------------------------------------------------------|-------------------------------------------------------------------------------------------|----------------------------|--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
| PNP | Class | Pathway elucidation | Key engineering strategy | Chassis | Reported titer |
| Artemisinic acid | Sesquiterpenoid | Complete (ADS, CYP71AV1, DBR2, ALDH1) | P450 redox-partner balancing; MVA amplification | S. cerevisiae | 25 g/L (fed-batch, industrial process) href="#bb0570" 114 |
| Taxadiene / baccatin III | Diterpenoid | Essentially complete (TS, T5H, TOT, T9αH, oxetane synthase) | MEP/MVA balancing; ER-targeted P450s | E. coli; N. benthamiana | 1 g/L taxadiene (E. coli ); baccatin III reconstituted in tobacco href="#bb0575" 115, href="#bb0580" 116 |
| QS-21 | Triterpene saponoid | Complete (38 enzymes incl. 7 UGTs) | MVA + UDP-sugar supply enhancement; 16 genomic edits | S. cerevisiae | ~0.0012 mg/L (complete de novo pathway) href="#bb0055" 11 |
| Catharanthine / vindoline (vinblastine precursors) | TIA alkaloid | Complete (30 enzymatic steps) | 56 genomic edits; chimera P450s; chemical coupling | S. cerevisiae + in vitro | 108 mg/L catharanthine; 25 mg/L vindoline href="#bb0050" 10 |
| Catharanthine (with VinBLAST scaffold) | TIA alkaloid | SGD-GS metabolon identified (VinBLAST) | Scaffold-protein channeling of strictosidine aglycone | S. cerevisiae | ~160 mg/L catharanthine (~1000-fold improvement) href="#bb0585" 117 |
| (S)-Reticuline | BIA | Complete (NCS, CYP76AD5, etc.) | 7 oxidoreductase knockouts; CjNCSΔN35; pulsed feeding | S. cerevisiae | 4.6 g/L href="#bb0590" 118 |
| Sanguinarine | Benzophenanthridine alkaloid | Complete | SIMTGeS temperature-induction decoupling growth/production; flavoprotein/P450 engineering | S. cerevisiae | 448.64 mg/L; halogenated derivatives href="#bb0435" 87 |
| Scopolamine / hyoscyamine | Tropane alkaloid | Complete | Vacuole-targeted acyltransferase; functional genomics | S. cerevisiae | de novo from sugars/amino acids href="#bb0595" 119 |
| Pinoresinol | Lignan | Complete (PsVAO/laccase/PrR/PLR cascades) | H2O2 auto-scavenging cascade; CRISPR chromosomal integration | E. coli / in vitro | 11.29 g/L (in vitro cascade); 100 mg/L (plasmid-free E. coli ) href="#bb0600" 120, href="#bb0605" 121 |
| Lariciresinol diglucoside | Lignan glycoside | Complete (>40 steps) | Obligately mutualistic yeast consortium (met15Δ--ade2Δ); ferulic acid metabolic bridge | S. cerevisiae consortium | de novo synthesis demonstrated href="#bb0610" 122 |
| Coniferyl alcohol | Lignan precursor | Complete | | | |
5 植物天然产物的异源合成
植物天然产物类药物疗效明确，对人类健康不可或缺，但存在一个突出短板：即便只是作为化学合成前体，绝大多数仍需直接从植物原料中提取分离。很多植物天然产物具有复杂的立体化学结构与氧化修饰，导致从头全化学合成难以实现。传统生产模式消耗大量植物资源，同时天然产物本底含量低，最终造成药物成本高昂。因此，开展植物天然产物的异源合成研究具有十分重要的意义。
5.1 将生物合成通路导入异源宿主
在微生物宿主中重构植物生物合成通路面临诸多难题，包括前体供给、膜结合型 P450 酶的功能性表达、产物细胞毒性、辅因子平衡以及放大生产的复杂性。下面通过典型研究案例，介绍研究者如何系统性解决这些相互关联的瓶颈问题。
5.1.1 萜类的异源合成
萜类提取难度大、化学合成困难，异源合成技术因此极具应用价值。微生物（尤其是大肠杆菌、酿酒酵母等酵母）已经成为萜类生物合成最主流的底盘。大肠杆菌作为典型原核体系，优势是生长快、培养简单、遗传操作工具成熟，适合高通量基因筛选。借助代谢工程改造，大肠杆菌已经可以合成多种萜类，包括单萜、倍半萜、二萜、三萜与四萜。MEP 与 MVA 通路协同改造后，异戊二烯产量大幅提升至约 24 g/L。通过平衡上游 MEP 通路通量与下游萜类合成，研究者在大肠杆菌中实现紫杉二烯最高 1 g/L 的产量，同时减少吲哚副产物积累。尽管多种萜类在大肠杆菌中的产量已经得到大幅优化，但涉及细胞色素 P450（CYP450）的萜类合成在大肠杆菌中始终是一大难点，主要原因在于这类酶属于膜结合蛋白。
酵母是萜类合成的优选底盘。作为真核生物，酵母相比大肠杆菌更适合表达需要 CYP450 参与的萜类合成通路。青蒿酸是抗疟药物青蒿素的关键前体；其合成通路解析后，研究者鉴定到青蒿醛脱氢酶（ALDH1）、细胞色素 P450 单加氧酶 CYP71AV1、细胞色素 P450 还原酶（CPR1）、细胞色素 b5（CYB5）等关键酶。将这套酶系统整合进酿酒酵母后，青蒿酸产量由 1.6 g/L 提升至 25 g/L。 耶氏解脂酵母是非模式产油酵母，在萜类合成中也有重要应用：该菌天然可大量合成乙酰辅酶 A（MVA 通路起始底物），有利于萜类前体 GPP、FPP、GGPP 积累。研究者利用通量平衡分析（FBA）、PlackettBurman 试验设计等代谢工程策略，在耶氏解脂酵母中实现番茄红素产量最高 242 mg/L。近年一项里程碑式工作在改造酵母中完成皂苷类疫苗佐剂 QS21 的从头合成。QS21 含有三萜母核，带有分支三糖、醛基修饰单糖以及 C18 酰基链；该通路重构需要表达 38 个酶（含 7 个植物糖基转移酶、1 个底物宽泛的酰基转移酶），同时进行 16 处基因组编辑以强化 MVA 通路与 UDP糖供给。虽然初始产量很低（约 0.0012 mg/L），但该研究搭建了目前最长的植物天然产物异源合成通路，并且建立了可单独优化糖基化、酰基化模块的底盘。
基于植物的同源或异源表达体系进一步拓展了萜类合成策略。将由 CaMV 35S 启动子驱动的柠檬烯合酶、柠檬烯3羟化酶导入薄荷，柠檬烯含量提升 40 倍。类似地，在青蒿中共表达 HMGR、FPPS、DBR2，青蒿素积累量提升 3 倍。本氏烟草作为瞬时表达宿主，能够快速表达其他植物来源的基因与酶。
5.1.2 生物碱的异源合成
生物碱在酿酒酵母、大肠杆菌以及植物体系中的异源合成已经取得大量进展。大肠杆菌生长迅速、遗传操作简便，适合通路较短的生物碱合成。秋水仙碱等苯乙基异喹啉生物碱（PEIA）是重要临床天然产物，但传统植物提取产量不稳定。Gao 等人构建了一套人工四酶级联催化体系，绕开植物 P450 修饰步骤实现 PEIA 合成；通过酶筛选与蛋白改造，敲除 7 个醛还原酶基因构建大肠杆菌 IAA 工程菌株，在 300 mL 生物反应器中得到 1.90 mM（709.06 mg/L）的 (S)秋水仙碱前体 autumnaline，验证了工艺放大潜力。 (S)加拿定是下游苄基异喹啉生物碱，具备药用潜力，也是小檗碱、那可丁合成的关键前体。Zhang 等人过表达改造后的 4羟基苯乙酸 3单加氧酶（HpaBCD11）与嘌呤核苷磷酸化酶 DeoD，提升多巴胺通量，同时解除酪胺介导的反馈抑制；借助半理性设计与蛋白支架策略解决小檗碱桥酶（BBE）、加拿定合酶（CAS）的表达难题，实现大肠杆菌中 (S)加拿定从头合成，产量 165.74 mg/L。 石蒜科生物碱（如治疗阿尔茨海默病的加兰他敏）属于结构高度复杂的植物次生代谢物。Oelsnitz 等人搭建 "生物传感器机器学习" 催化酶开发流程，构建基于结构的残差神经网络 MutComputeX 用于改造植物甲基转移酶变体；经生物传感器筛选获得的优化酶，产物滴度提升 60%、催化活性提高 2 倍、异构化率下降 2/3。
酿酒酵母具备真核特征（亚细胞区室、内质网系统、成熟遗传工具），成为生物碱异源合成的优选底盘。Srinivasan 等人在工程酵母中以简单糖和氨基酸为原料，完整合成药用托品烷生物碱 ------ 莨菪碱与东莨菪碱。二者是治疗神经肌肉相关疾病（神经毒性损伤、帕金森病等）的重要药物；传统从颠茄类植物提取，供应链易受野火、疫情等扰动，化学合成经济性差。研究者结合功能基因组、蛋白改造与菌株优化，鉴定到通路缺失酶，并实现酰基转移酶的液泡靶向表达。 Gou 等人在深度改造酵母中实现血根碱及其卤代衍生物的全合成；构建温度可控基因表达的合成诱导模块 SIMTGeS，实现菌体生长与产物合成解偶联，并通过蛋白工程优化黄素蛋白与 CYP 功能。改造后血根碱产量达到 448.64 mg/L，同时成功合成氟化衍生物。 长春碱是 WHO 基本药物，用于霍奇金淋巴瘤治疗。Zhang 等人采用 "酵母微生物合成长春质碱 + 文多灵，体外化学偶联" 的半合成路线。该通路从牻牛儿焦磷酸与色氨酸起始，共 30 步酶促反应，包含 56 处遗传修饰：表达 34 个植物异源基因，同时敲除或过表达 10 个酵母内源基因；实现长春质碱（108 mg/L）、文多灵（25 mg/L）的从头合成。 Payne 等人通过 CYP 嵌合改造，将双苄基异喹啉（BBIQ）通路产量提升 10 000 倍，同时改变产物特异性，专一合成贝巴明；共表达 SiCNMT2 与 NnOMT5，实现木兰箭毒碱与杏黄罂粟碱合成。 Bourgeois 等人开发酵母四氢异喹啉（THIQ）合成平台，(S)瑞枯灵产量达到 4.6 g/L，改造策略包括：1）敲除 7 个氧化还原酶基因稳定醛中间体；2）截短 CjNCSΔN35 提升催化效率；3）CYP76AD5 介导的羟基化优化；4）补料分批策略平衡生物量与产物。将 Ehrlich 通路与 NCS 结合，利用内源、外源醛库获得丰富 THIQ 结构，可用于阿片类生物碱合成，共得到上千种 THIQ 变体。 2026 年 Gao 等人报道，一类肉桂醇脱氢酶同源蛋白 VinBLAST 作为支架蛋白，在细胞核内将异胡豆苷 β葡萄糖苷酶（SGD）与喜果苷合酶（GS）物理偶联，把极不稳定的异胡豆苷苷元在两个空间分隔的反应之间定向转运，并别构激活 GS 催化效率。在酵母中表达不同植物来源的 VinBLAST 同源蛋白后，长春质碱产量提升至约 160 mg/L，较之前报道提升近 1000 倍，其他单萜吲哚生物碱产量也同步提升。该研究补齐了单萜吲哚生物碱代谢元组装的关键缺失环节，证明利用支架蛋白（而非单纯增加酶拷贝）可以解决中间体不稳定这一限制生物碱产量的核心瓶颈。
本氏烟草也被用于生物碱异源合成。Nett 等人在本氏烟草中成功重构秋水仙碱合成通路。结合转录组、代谢逻辑与通路重构，在没有基因组参考的条件下从嘉兰中鉴定 8 个基因，负责合成 N甲酰去甲基秋水仙碱前体；其中一个非典型 P450（CYP71FB1）催化关键的卓酚酮环扩张，形成秋水仙碱标志性七元芳香环。该研究解开了长达 60 年的秋水仙碱合成谜团，为非模式植物通路向模式底盘移植建立范式，是植物合成生物学在天然产物领域的代表性工作。
5.1.3 木脂素的异源合成
松脂醇是鬼臼毒素以及临床药物依托泊苷、替尼泊苷的核心木脂素前体。 Ricklefs 等人利用 PsVAO、细菌漆酶、AtPrR2、FiPLR 构建三步级联反应，以丁香酚为底物合成高对映体纯的松脂醇，对映体过量值 98%；替换最后一步还原酶即可获得不同构型的松脂醇，解决了天然提取效率低、难以获得手性纯松脂醇的难题。 Lv 等人设计由香草醇氧化酶与过氧化物酶组成的体内级联体系，可以原位清除 H₂O₂，无需蛋白纯化与外加辅因子；优化条件后松脂醇产量达到 11.29 g/L，摩尔得率 52.77%，生产强度 1.03 g/(L・h)；1.5 L 反应体系中实现当时最高产量、得率与生产强度。 2021 年 5 月 Xiao 等人解析 PLR/PrR（木脂素合成关键酶，决定产物结构多样性）底物特异性的分子机制，为下游药用木脂素落叶松脂素的商业化大规模生产提供方案。 2023 年 7 月 Chen 等人在菘蓝中解析 (−)落叶松脂素立体选择性合成完整通路，共三步：立体选择性 DIR1/2、PLR、UGT71B2。DIR1 是关键基因，调控其表达可以提升木脂素产量，为后续植物中木脂素增产奠定基础。 Qiao 等人以丁香酚为底物，采用多细胞一锅法，在大肠杆菌中成功合成菘蓝木脂素通路的 10 种化合物。构建 pCDFDuetPrx02PsVAO 菌株得到 698.9 mg/L 松脂醇；多细胞一锅体系得到落叶松脂素 434.08 mg/L、开环异落叶松脂素 96.81 mg/L、鬼臼毒素 45.14 mg/L；搭配底物特异性严格的 UDP糖基转移酶合成糖苷产物，包括松脂醇葡萄糖苷 1.71 mg/L、落叶松脂素 4O葡萄糖苷 1.3 mg/L、落叶松脂素 4'O葡萄糖苷 836 μg/L 等多种糖苷。该框架为木脂素异源生物合成与增产打下基础。 Luelf 等人开发 CRISPR/Cas9 辅助工具，方便将 pET 载体上的基因整合至大肠杆菌染色体；利用基因剂量效应，松脂醇产量达到 100 mg/L，既提供松脂醇合成路线，也为大肠杆菌无质粒级联催化体系搭建平台。
鬼臼毒素通路中，除松脂醇外，松柏醇也是重要上游中间体。Chen 等人利用微生物共培养体系，首次在微生物中合成松柏醇，最高产量 124.9 mg/L，既为松脂醇合成铺路，也证明共培养体系可抑制副反应。Yang 等人在酿酒酵母中实现松柏醇异源合成，产量 201.1 mg/L，转化率 62.5%，为下游药用木脂素合成提供支撑。Wang 等人导入外源蛋白 ESTB 提升细胞对前体阿魏酸的耐受性，进一步提高松柏醇产量；摇瓶发酵达到 742.8 mg/L，5 L 发酵罐中可达 1315.3 mg/L，该研究突出了苯丙烷类合成中前体调控的重要性。
下游通路中，去氧鬼臼毒素是一线抗癌药依托泊苷苷元的前体，在依托泊苷合成中至关重要。2019 年 11 月 Schultz 团队在烟草中导入改造后的合成通路，去氧鬼臼毒素产量达到 0.71 mg/g 植物干重，证明长合成通路可以从珍稀药用植物移植到烟草底盘。
近期 Chen 等人将木脂素通路拆分到专性共生的酿酒酵母共培养体系（met15Δ ade2Δ 营养缺陷株），以阿魏酸作为上下游菌株之间的代谢桥梁。这种分工模式克服单菌重构中普遍存在的代谢混杂问题（尤其是 4香豆酸辅酶 A 连接酶的非特异性酰化副反应），实现松脂醇、落叶松脂素的从头合成；并通过 40 余步酶促反应合成抗病毒活性物质落叶松脂素二葡萄糖苷。该研究证明：对于步骤长、酶底物宽泛的通路，模拟植物细胞代谢分工的共培养底盘优于单一菌株改造，也用糖苷类药用产物验证了前文 4.1 部分提到的共培养策略。
除鬼臼毒素类化合物外，还有很多重要木脂素：如用于胃癌治疗的二叶素、抗乙肝的 helioxanthin、兼具抗癌与抗氧化活性的牛蒡子苷元；遗憾的是，目前尚无这三种化合物异源合成的报道。部分木脂素已经可以通过异源合成获得，例如芳基四氢萘型的异落叶松脂素、双呋喃型芝麻素、二苄基丁内酯型罗汉松脂素，可通过微生物发酵或植物细胞培养生产。
不同底盘各有优势：大肠杆菌生长快、成本低，但难以表达复杂蛋白；酵母具备真核加工能力，但改造难度更高；本氏烟草适合植物来源通路，但基因组复杂。
综上，这些案例可以总结出一套实用的底盘选择原则（见图与汇总表格）： （1）通路全部由可溶性酶组成、总步数约 10 步以内：如果前体供给可行（如内源 MEP 提供 IPP/DMAPP，或导入酶获得苯丙烷前体），优先选用大肠杆菌，构建最快、成本最低； （2）通路包含膜结合 P450、需要内质网 / 液泡等真核区室完成蛋白折叠或产物隔离，或是总步数超过约 20 步：优先选择酿酒酵母；产物富含乙酰辅酶 A 衍生物时优先选用耶氏解脂酵母等产油酵母； （3）依赖植物特有细胞器、存在高度不稳定中间体（植物依靠代谢元进行定向转运）、通路本身尚未完全解析：优先用本氏烟草瞬时表达；代价是成本更高、产量偏低，但通路成功组装概率更高。
在实际操作中，绝大多数植物天然产物目标产物最有效的分步策略是：先在大肠杆菌或本氏烟草中完成基因功能鉴定，再转到酵母中进行产量优化。
图 9 植物天然产物传统供给途径与合成生物学异源生产体系，包含植物提取、化学合成的局限性；代表性微生物与植物底盘；以及用于提升产物产量的四项核心代谢工程策略。
除静态过表达策略外，动态调控、前体 / 辅因子通路重塑被证实是缓解通路通量失衡的关键手段。动态调控可以实现菌体生长与产物合成解偶联：例如 SIMTGeS（温度可控基因表达合成诱导模块）系统，利用内含肽介导的温度开关，待生物量积累完成后再启动血根碱合成通路；结合 P450 与黄素蛋白改造，最终实现 448.64 mg/L 的产量。代谢物响应型、生长阶段响应型启动子（如 HXT1、MET3）以及群体感应回路，可仅在生长阶段结束后抑制 ERG9/ERG7 介导的竞争通路，避免持续抑制造成的固醇营养缺陷。 前体重塑能够扩充异源通路的胞内前体库：过表达乙酰辅酶 A 羧化酶增加丙二酰辅酶 A 供给，支撑聚酮与脂肪酸衍生修饰；解除芳香氨基酸合成的反馈抑制（例如酵母中抗反馈突变 Aro4/Aro7），为生物碱通路提供酪氨酸、色氨酸底物。 辅因子重塑同样至关重要，植物天然产物通路以氧化还原反应为主：过表达 POS5、强化氧化磷酸戊糖途径以重构 NADPH 再生系统，重新平衡 NADH/NADPH 比例，直接保障连续的 P450 与还原酶催化反应。机器学习辅助辅因子工程结合代谢重编程，同样提升了大肠杆菌中 NMN（β- 烟酰胺单核苷酸）的产量，证明该策略可广泛适用于植物天然产物细胞工厂。
当前研究大多聚焦单一底盘体系的优化。而前沿策略越来越多地采用微生物共培养体系，将复杂、多步的生物合成通路拆分到多个专门改造的工程菌株中。这种分工模式降低了单菌株的代谢负担，缓解中间体毒性，提升合成效率。 对于部分生物碱、萜类等具有细胞毒性的产物，合成产量不仅取决于酶动力学参数，还和代谢通量的空间排布密切相关。亚细胞区室化、将酶靶向液泡或内质网等细胞器、构建人工酶复合物，可形成代谢元，在特定微环境中富集酶与辅因子。这种空间约束能够降低不稳定中间体的扩散，避免其和内源代谢发生交叉反应，从而隔离毒性中间体，同时提升通路通量与菌株遗传稳定性。 此外，对于合成通路冗长、依赖植物特有细胞器与修饰酶的复杂天然产物（如秋水仙碱），植物底盘（尤其是本氏烟草）具备独特优势。瞬时表达结合基因编辑技术，可以利用植物自身代谢网络与亚细胞结构（叶绿体、内质网小体等）重构微生物底盘中难以实现的复杂通路。
上文引用的多数产量数据来自摇瓶或小体系（300 mL--1.5 L），放大至工业发酵罐会面临更多限制条件。高氧化型通路常常受限于传氧效率：青蒿酸工业化工艺需要改造菌体摄氧系统，在补料分批大发酵罐中精准控制溶氧，支撑多步 P450 催化，后续再通过化学转化得到青蒿素。 补料分批与脉冲补料策略可实现生长与合成解偶联，例如 (S)- 瑞枯灵 4.6 g/L 工艺中的脉冲补料、SIMTGeS 温度诱导方案，都能够缓解溢流代谢和中间体毒性。 下游分离纯化（DSP）同样起到决定性作用：大部分植物天然产物存在于胞内，细胞破碎、溶剂萃取、色谱纯化占据绝大部分生产成本。原位产物吸附（双液相发酵）、分泌工程（如过表达转运蛋白）、胞外酶级联反应等方式可以降低下游纯化压力；典型例子包括体外级联反应得到 11.29 g/L 松脂醇（生产强度 1.03 g/(L・h)），以及 5 L 发酵罐中 1315.3 mg/L 松柏醇的合成。总体而言，仅看产量不足以评判商业化潜力；工艺设计初期就需要同步优化体积生产强度、底物得率以及下游纯化成本。
总而言之，异源合成策略正在重塑植物天然产物的生产模式，由依赖资源的提取工艺转向设计驱动的发酵生产。合成生物学通过将完整或模块化通路导入改造后的微生物、植物底盘，结合亚细胞区室工程与代谢优化，搭建起多尺度集成生产框架，支撑结构复杂的高价值植物天然产物的可持续供给。
尽管取得上述进展，仅导入通路很难实现高效合成。现有平台仍面临诸多瓶颈：酶催化效率偏低、膜结合型 P450 功能性表达困难、前体与辅因子供给失衡、中间体具有细胞毒性，且通路越长，菌株稳定性越差。传统单因素优化很难同时解决这些问题。因此，人工智能与机器学习辅助手段被引入，并非独立技术，而是设计 - 构建 - 测试 - 学习（DBTL）循环的组成部分，用于优先筛选酶突变体、定位代谢改造靶点、指导多变量通路优化。
5.2 推动植物天然产物生物合成发展与应用的新技术
近年来，人工智能在植物天然产物生物合成领域取得显著进展。机器学习、深度学习作为前沿计算方法，为代谢优化与蛋白工程开辟了新方向。人工智能技术正深度融入植物天然产物生物制造的 DBTL 循环，覆盖通路与酶设计、菌株改造、高通量数据分析等环节，推动工艺开发从经验试错转向数据驱动的精准优化。
图 10 人工智能在植物天然产物生物合成中主要应用于代谢工程与蛋白工程领域。人工智能与生物合成技术相结合，加快了传统实验筛选的速度，实现基于数据驱动的酶功能理性优化。
在代谢优化领域，机器学习在代谢网络建模方面表现突出。例如，基于支持向量机（SVM）的机器学习模型已成功用于植物生物碱生物合成网络分析。此外，Yong Jun Choi 等人借助机器学习对预测靶点基因进行调控，大幅提升番茄红素产量。熊等人建立代谢重编程联合机器学习辅因子工程的协同策略，有效促进 β- 烟酰胺单核苷酸（NMN）合成。以上案例说明，机器学习推动代谢工程由单因素调试转向模型指导下的系统性菌株改造，对于通路冗长、实验成本高的植物天然产物研究尤为重要。
与此同时，借助高精度代谢模型构建与动态调控网络优化，人工智能极大推动代谢工程发展。例如，人工智能用于代谢工程，助力细胞代谢模型的搭建与优化。瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）开发的 AI 工具 RENAISSANCE，整合多组学数据构建大肠杆菌动力学代谢模型，为工业菌株设计提供有力工具。人工智能技术的发展推动代谢工程向着智能化、高精度方向迈进。这类 AI 驱动的代谢模型有望为未来植物天然产物生物制造中的底盘选择、通路插入以及过程控制提供定量蓝图。
在蛋白工程领域，机器学习整合多维生物学数据构建预测模型，为酶的理性设计与改造提供理论指导。深度学习具备强大特征提取能力，可以从复杂蛋白数据中挖掘隐藏规律。例如 AlphaFold2 依靠深度学习实现蛋白结构预测，优势显著。王等人基于 AlphaFold2 预测的谷氨酸脱氢酶（GluDH）结构，设计 A145G/P144A/V143A 突变体，显著提升该酶对大位阻底物的催化活性。蛋白复合物建模与表征学习的先进流程进一步加速生物催化剂开发。基于 AI 的蛋白工程将源源不断为植物天然产物通路提供定制化酶与蛋白复合物，弥补仅依靠传统酶挖掘手段难以获得目标催化剂的短板。
代表性研究案例既展示了 AI 在天然产物工程中的潜力，也暴露其现有局限。MutComputeX 是一种结合结构引导残差神经网络与生物传感器筛选的工具，研究者利用它重新设计石蒜科甲基转移酶 PsOMT3，得到突变体产物滴度提升 60%、催化活性提高 2 倍、异构化率降低 2/3。前面提到洛桑联邦理工学院开发的 RENAISSANCE 工具，采用生成式机器学习直接从多组学数据构建大肠杆菌大规模动力学模型，定量预测胞内代谢状态与改造靶点。机器学习预测改造靶点同样显著提升酵母中番茄红素产量。尽管取得诸多进展，但仍存在明显短板：基于模式生物训练的模型很难迁移到植物酶与非模式底盘；绝大多数植物天然产物通路缺少监督学习所需的标准化定量数据集；实验通量跟不上数据产出速度，AI 预测结果很少在工业化生产规模上验证。只有将 AI 设计与自动化 DBTL（设计 - 构建 - 测试 - 学习）平台深度结合、统一通路数据上报标准，才能打通闭环。
人工智能不仅缩短传统实验筛选周期，还实现酶性能系统性的数据驱动优化。但想要让 AI 成为植物天然产物生物制造的常规技术，仍需攻克不少难题：天然产物生物合成高质量定量数据稀缺、模型跨底盘泛化能力不足、和高通量实验平台融合程度低。未来，随着人工智能与生物合成技术持续融合，合成生物学将向着更高精度、智能化方向发展。
5.3 异源合成平台现存瓶颈
当前合成平台存在一些固有局限，亟待正视。 第一，膜蛋白表达难题：植物 P450 酶及其还原酶在微生物膜内经常错误折叠，氧化还原伴侣偶联效率低；虽然氧化还原伴侣平衡、N 端改造、CPR 融合等手段有一定改善，但 P450 催化步骤依旧是天然产物通路最常见的通量限制节点。 第二，复杂长通路组装：需要表达 15--20 种以上异源酶的通路普遍存在代谢负担重、遗传不稳定、基因表达失衡等问题；模块化组装、染色体整合、菌群分工策略只能缓解，无法彻底消除。 第三，产物分离纯化：多数天然产物在胞内积累，浓度偏低，提取纯化占据生产成本大头；分泌工程、原位回收技术前景广阔，但尚不成熟。 第四，放大生产与经济性问题：在小体系富培养基中得到的优异性能，往往无法直接复制到工业补料分批发酵、廉价底物体系；许多天然产物的发酵成本仍高于植物提取。蛋白工程、通路动态调控、工艺工程与技术经济分析需要协同推进，逐步突破这些瓶颈。
6 结论
植物天然产物广泛应用于医药、工业等领域。目前获取天然产物的主流方式仍是从植物中提取分离。但很多天然产物在植物体内含量极低，传统生产消耗大量植物资源，造成相关药物价格高昂，同时给野生植物种群带来生存压力。与之相比，利用合成生物学构建工程微生物细胞进行发酵合成，是全新生产模式。该模式降低对植物原料的依赖，易于放大，有望减轻对生态环境的破坏。在此背景下，药用天然产物生物合成通路解析与重构成为领域研究重点。
多组学与 AI 辅助技术助力关键合成酶的挖掘与功能鉴定，结构生物学与计算方法阐明酶催化机制。理性设计与结构导向改造进一步提升酶催化性能。
即便合成通路已经解析、限速酶完成优化，构建高效的天然产物微生物细胞工厂仍面临诸多挑战：天然产物及其合成中间体在微生物胞内积累，产生宿主毒性、抑制产物合成、引发副反应。该问题在细胞色素 P450（下游修饰的核心酶）、代谢物转运储存系统、底盘适配等关键环节尤为突出。持续优化底盘代谢、平衡内源与异源通路通量，是突破瓶颈的核心。随着研究推进，会有更多天然产物通路在适配性更好的新型底盘中实现重构。这类进展不仅可以降低天然产物药物成本，也能助力新药挖掘与开发。
工业化放大是一大关键难点，需要优化传氧、开发补料策略、提升下游纯化效率；后续研究必须将工艺创新和菌株改造结合起来。
下一阶段领域的突破将来自多方向协同发展。对于生物碱、高度氧化修饰萜类，要补齐骨架形成与后修饰通路，同步开发普适性 P450 表达方案、氧化还原伴侣平衡策略与膜蛋白折叠技术。静态过表达将逐步被传感器调控、AI 引导的动态通路控制替代；区室化、支架蛋白、合成菌群等空间调控策略，可以模拟植物演化形成的代谢分工。工艺层面，补料调控、原位产物回收、非粮食廉价底物是重点；技术经济评估与生命周期评估将指导研究者判断哪些天然产物更适合生物合成而非植物提取。以上方向的进展，决定微生物与植物细胞工厂能否从实验室示范走向药用天然产物的商业化供应。
展望未来，该领域将在三个方向协同推进。技术层面，AI 将贯穿整个研发链条，覆盖酶设计、通路优化到发酵控制；搭配自动化机器人平台，AI 会加速 DBTL 循环，实现合成体系持续迭代优化。产物开发层面，组合生物合成通过模块化组装不同物种来源的酶，创制活性更优的 "非天然天然产物"，拓展药物筛选的化学空间。工业化层面，重心转向利用非粮食生物质的低碳生物工艺，同时提升菌株鲁棒性与发酵稳定性。归根结底，发酵成本与植物提取成本持平，才能建成真正可持续、具备经济竞争力的天然产物供应链。综上，这些研究将减少野生植物采收，提升药物可及性，降低生态压力。