ROGUE: 【张院士团队R包】一种基于熵的用于评估单细胞群体纯度的度量标准

还是来源于之前那篇cancer cell，小伙伴对于其中的一些分析方式比较感兴趣，之前没有提及，所以分享一下。原文结果是这样描述的"Notably, based on RNA-seq ontology graphic user environment (ROGUE)......our clusters demonstrated high internal homogeneity......"，提到了一种方法ROGUE，可以判断细胞的同质性，或者说细胞群的纯度。

（reference：Cross-tissue human fibroblast atlas reveals myofibroblast subtypes with distinct roles in immune modulation）

看了一下，包出来很久了，2020年，是张泽民院士团队的，他们真的对单细胞领域贡献了好多方法。包的原文发表在Nature communications上，参考：An entropy-based metric for assessing the purityof single cell populations。这个包用于准确量化单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据中鉴定的细胞簇的纯度。作者证明ROGUE广泛适用，能够对各种模拟和真实数据集中的簇纯度进行准确、敏感和稳健的评估。他们表明ROGUE可以识别额外的细胞亚型，并有助于检测特定亚群中的精确生物信号。感觉说了又好像没说：那具体有啥用呢？就不套用官方的话了，用我自己的理解说一下，不对的地方还请批评指正。主要有两个方面可应用：

其一：ROGUE值可以用于识别纯度较高的细胞亚型。这应该是大多数人会遇到的一个问题，提取大类细胞做亚群鉴定，到底分几群才合适呢？很多人可能是佛系的听天由命。而ROGUE值恰好可以为我们提供一个参考判断。ROGUE越高，越接近1，表明细胞群越纯，反之表示细胞群异质性比较高，这个群体还可再细分，这样我们可以分离得到一些亚群。
其二：ROGUE可以用于评估批次效应的影响。这个主要针对多数据集的整合，或者不同来源数据整合，比如我们见过一篇文献就是多个公共数据库数据整合，建设审稿人问你如何确定不同数据集批次效应有无去除，单纯的放一个UMAP图可能说服不了他，那么就可以搬出ROUGE算法，计算每种celltype在不同来源/不同sample中的纯度，如果ROUGE高，细胞群体纯度高，批次效应弱！

分析超级简单，步骤不多，首先安装包：

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#github链接：https://kkgithub.com/PaulingLiu/ROGUE#教程链接：https://htmlpreview.github.io/?https://kkgithub.com/PaulingLiu/ROGUE/blob/master/vignettes/ROGUE_Tutorials.html
#install.packages("tidyverse") 这个是依赖包，之前没有的话先安装if (!requireNamespace("devtools", quietly = TRUE)) install.packages("devtools")devtools::install_github("PaulingLiu/ROGUE")#下载安装不成功也可以本地安装，本地包下载地址https://codeload.github.com/PaulingLiu/ROGUE/legacy.tar.gz/HEAD

加载数据（我们演示的数据时一个Epi亚群初步分群的数据），提取矩阵和metadata：过滤低质量细胞和表达量低的基因。

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setwd('D:\\KS项目\\公众号文章\\ROUGE单细胞纯度分析')
#安装包# if (!requireNamespace("devtools", quietly = TRUE)) install.packages("devtools")# devtools::install_github("PaulingLiu/ROGUE")
library(Seurat)library(ROGUE)library(tidyverse)library(ggplot2)library(ggrastr)#-------------------------------------------------------------------------------expr <- GetAssayData(Epi, assay = 'RNA',layer = 'counts') %>% as.matrix()meta <- Epi@meta.data
#filter genes and cellsexpr <- matr.filter(expr, min.cells = 10, min.genes = 10)

计算表达熵模型，这是后续的基础：

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ent.res <- SE_fun(expr)SEplot(ent.res)

ROGUE calculation，这个是针对整个Epi细胞群体的计算，得到的最终值是0.3很低，说明Epi群体异质性很大，这个是符合的，且不说Epi可以分亚群，我们这个演示数据的Epi包含的还是正常人和肿瘤病人的Epi，那自然异质性更大了。

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rogue.value <- CalculateRogue(ent.res, platform = "UMI")#[1] 0.339205

为了获得每个聚类的准确纯度估计值，计算不同样本中每种细胞类型的ROGUE值。并用箱线图可视化结果！

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rogue.res <- rogue(expr, labels = meta$seurat_clusters, samples = meta$orig.ident, platform = "UMI", span = 0.6)

#这组颜色来源于cancer cell，可以收藏myColor <- c("#E41B1B", "#4376AC", "#48A75A", "#87638F", "#D87F32", "#737690", "#D690C6","#B17A7D", "#847A74", "#4285BF","#204B75", "#588257", "#B6DB7B", "#E3BC06", "#FA9B93", "#E9358B", "#A0094E", "#999999", "#6FCDDC", "#BD5E95")#宽数据转化为长数据格式，使用ggplot作图plotData <- rogue.res %>%  tidyr::gather(key = clusters, value = ROGUE) %>%  filter(!is.na(ROGUE))#散点箱线图ggplot(data = plotData, aes(clusters, ROGUE, color = clusters)) +  geom_boxplot(outlier.shape = NA) +#添加box  geom_jitter_rast(shape = 16, position = position_jitter(0.2)) +#添加抖动散点  scale_color_manual(values = myColor) +  theme_classic() +  theme(    axis.text = element_text(size = 12, colour = "black"),    axis.title = element_text(size = 13, colour = "black")  ) +  labs(x = "", y = "ROGUE index") +  ylim(0, 1)

以上我们使用的是一个亚群分析的数据，可能有些例子举的不是很恰当，但是也可以作为参考。同时我们也演示另外一组数据，关于批次效应的数据演示这是一个大型数据集，合并了多个数据库不同来源的同一组织的单细胞数据，这里使用ROGUE验证一下。合并公共数据库最让人担心的问题不就是怕批次效应，或者数据集差异，最终得到错误结果。分析和前面一样，很简单。对于这个数据，最后我们计算了每个样本的cluster纯度，以及每个数据库下cluster纯度，发现ROGUE还可以，说明批次效应较小。

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library(Seurat)library(ROGUE)library(tidyverse)library(ggplot2)library(ggrastr)
# Rce <- subset(sce, sequencing=='scRNA_seq')#单细胞seurat obj#-------------------------------------------------------------------------------expr <- GetAssayData(Rce, assay = 'RNA',layer = 'counts') %>% as.matrix()meta <- Rce@meta.data
#filter genes and cellsexpr <- matr.filter(expr, min.cells = 15, min.genes = 15)#-------------------------------------------------------------------------------
ent.res <- SE_fun(expr)SEplot(ent.res)
#-------------------------------------------------------------------------------#ROGUE calculation
rogue.value <- CalculateRogue(ent.res, platform = "UMI")

rogue.res.sample <- rogue(expr, labels = meta$celltype, samples = meta$orig.ident, platform = "UMI", span = 0.6)rogue.res.database <- rogue(expr, labels = meta$celltype, samples = meta$database, platform = "UMI", span = 0.6)

write.csv(rogue.res.sample, file = 'rogue.res.sample.csv')write.csv(rogue.res.database, file = 'rogue.res.database.csv')

可视化：

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rogue_sample <- read.csv('rogue.res.sample.csv', header = T,row.names = 1)myColor <- c(  "#E41B1B", "#4376AC", "#48A75A", "#87638F", "#D87F32", "#737690", "#D690C6", "#B17A7D", "#847A74", "#4285BF",           "#204B75", "#588257", "#B6DB7B", "#E3BC06", "#FA9B93", "#E9358B", "#A0094E", "#999999", "#6FCDDC", "#BD5E95")plot_rogue_sample <- rogue_sample %>%  tidyr::gather(key = clusters, value = ROGUE) %>%  filter(!is.na(ROGUE))ggplot(data = plot_rogue_sample, aes(clusters, ROGUE, color = clusters)) +  geom_boxplot(outlier.shape = NA) +  geom_jitter_rast(shape = 16, position = position_jitter(0.2)) +  scale_color_manual(values = myColor) +  theme_classic() +  theme(    axis.text = element_text(size = 12, colour = "black"),    axis.title = element_text(size = 13, colour = "black")  ) +  labs(x = "", y = "ROGUE index") +  ylim(0, 1)

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rogue_database <- read.csv('rogue.res.database.csv',header = T,row.names = 1)plot_rogue_database <- rogue_database %>%  tidyr::gather(key = clusters, value = ROGUE) %>%  filter(!is.na(ROGUE))ggplot(data = plot_rogue_database, aes(clusters, ROGUE, color = clusters)) +  geom_boxplot(outlier.shape = NA) +  geom_jitter_rast(shape = 16, position = position_jitter(0.2)) +  scale_color_manual(values = myColor) +  theme_classic() +  theme(    axis.text = element_text(size = 12, colour = "black"),    axis.title = element_text(size = 13, colour = "black")  ) +  labs(x = "", y = "ROGUE index") +  ylim(0, 1)

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