PI3K/AKT通路因可驱动增殖、代谢与存活，在88%的GBM中被激活，被视为对抗TMZ耐受的潜在干预节点。但泛PI3K抑制剂的临床探索因毒性过高而受阻，提示需对PI3K各亚型进行精准剖析。
作者首先利用DepMap、TCGA、CGGA及中国胶质瘤基因组图谱四大公共数据库，对覆盖II--IV级胶质瘤及正常脑组织的转录组数据进行再注释，依据MGMT mRNA表达阈值（<0.5为MGMT缺陷，>0.5为MGMT阳性）划分样本。结果显示，PIK3CB/PI3Kβ的mRNA水平在所有PI3K催化亚基中最高，且该优势在MGMT缺陷与MGMT阳性肿瘤中均成立。
免疫组化进一步证实，高级别胶质瘤标本中PI3Kβ蛋白丰度显著高于PI3Kα、PI3Kδ与PI3Kγ，而低级别胶质瘤则表现出PI3Kα与PI3Kβ相当的表达。无论肿瘤复发状态、IDH突变与否、分子亚型或患者性别/年龄如何，PIK3CB始终占据表达优势，提示其是GBM的核心生存驱动因子。
接下来，作者利用DepMap与TCGA中配套的反向相蛋白阵列（RPPA）数据，将PI3K各亚基mRNA水平与AKT磷酸化水平进行Pearson关联分析。结果表明，仅在MGMT缺陷GBM细胞系与肿瘤组织中，PIK3CB mRNA与pAKT-S473/T308呈正相关（r=0.35--0.42，P<0.05），而其他亚基或MGMT阳性样本未见显著关联；抑癌蛋白PTEN与各亚基及pAKT的相关性则更微弱。作者进一步检索DepMap中TMZ的半数抑制浓度（IC50），发现MGMT缺陷GBM中PIK3CB表达越高，IC50越大（r=0.48，P=0.041），提示PIK3CB高表达与TMZ耐受密切相关。
为验证数据库结论，作者在MGMT缺陷、PI3Kβ高表达的SF295细胞与PI3Kβ低表达的LN229细胞中，分别用shRNA敲低PIK3CA、PIK3CB或PIK3CD。单独敲低PIK3CB即可显著抑制SF295细胞活力，而敲低PIK3CA或PIK3CD则无明显效果；当联合200 μM TMZ时，仅PIK3CB敲低与TMZ协同杀伤SF295细胞（P<0.01），对LN229细胞无额外影响。随后，作者采用CRISPR-Cas9系统在U87MG（PI3Kα/β共高）与SF295（PI3Kβ高）中分别敲除PIK3CA或PIK3CB。
结果显示，敲除PIK3CA未能影响AKT磷酸化，而敲除PIK3CB则显著降低pAKT水平；在TMZ联合处理实验中，PIK3CB敲除组细胞死亡率显著高于PIK3CA敲除组（P<0.05）。为确认PI3Kβ--AKT信号轴的上下游关系，作者在U87MG中外源表达持续激活形式的Myr-AKT1、Myr-AKT2或Myr-AKT3，随后采用PI3Kβ选择性抑制剂TGX-221与TMZ联合处理。
结果表明，Myr-AKT1与Myr-AKT3可显著削弱TGX-221/TMZ的细胞毒效应，而Myr-AKT2无此作用，说明AKT1与AKT3位于PI3Kβ下游并介导耐受。
在体外药敏实验中，作者选取PI3Kβ高表达SF295、PI3Kβ低表达LN229及正常人星形胶质细胞，分别加入20 μM的PI3Kα抑制剂BYL-719、PI3Kβ抑制剂TGX-221、PI3Kδ抑制剂CAL-101、PI3Kγ抑制剂CZC24832或泛PI3K抑制剂BKM120，并联合200 μM TMZ。
结果显示，TGX-221/TMZ组合在SF295中表现出显著的协同杀伤（Excess over Bliss, EOB=47.1%），而在LN229与星形胶质细胞中无协同或呈拮抗。降低TMZ剂量至50 μM后，20 μM TGX-221仍可与其协同抑制SF295与U87MG（EOB=45.5%与26.3%），同时对星形胶质细胞影响甚微（EOB=6.5%），提示选择性靶向PI3Kβ在保留正常细胞的同时可克服耐受。
动物实验部分，作者将SF295细胞皮下接种至SCID/Beige小鼠，11天后给予7.5 mg/kg TMZ、40 mg/kg TGX-221或二者联合腹腔注射，隔日一次，共两周。结果显示，单药处理组肿瘤体积虽略有减小，但与对照差异不显著；而联合组肿瘤体积显著缩小（P<0.05），治疗结束后11天仍保持稳定，提示TGX-221与TMZ在体内同样具有协同效应（EOB平均值18.5%）。
胶质母细胞瘤干细胞（GSC）被认为是耐受TMZ的核心亚群。作者利用此前从患者标本中分离的PI3Kβ高表达VTC-103/GSC与PI3Kβ低表达VTC-056/GSC，以及正常神经干细胞（NSC），进行成球实验。100 μM TMZ单独处理对GSC自我更新无影响；20 μM TGX-221单用即可显著抑制VTC-103/GSC与NSC成球，联合TMZ后协同指数达8.3%。为了避免过度杀伤造成的评估偏差，作者改用10 μM AZD6482，发现其与TMZ仅在VTC-103/GSC中产生79.2%的协同抑制，对VTC-056/GSC与NSC无显著作用，进一步证实PI3Kβ在GSC耐受中的关键角色。
TMZ的细胞与动物实验均采用了AbMole品牌的temozolomide（Cat#M2129）。该产品以高纯度粉末形式提供，批次稳定，溶解于DMSO后可直接用于体外细胞实验，亦可经腹腔注射用于小鼠模型。实验数据显示，该批次TMZ在200 μM与50 μM下均表现出预期的细胞毒性与动物体内活性，为研究结论的可重复性与转化潜力提供了坚实基础。
综上，PI3Kβ在MGMT缺陷GBM中表达最高，且通过AKT1/3轴驱动TMZ耐受；选择性抑制PI3Kβ可在体外、体内及GSC层面与TMZ协同杀伤肿瘤，而对正常星形胶质细胞影响甚微。PIK3CB高表达可作为MGMT缺陷GBM的预后指标与干预靶点。未来，需进一步在正位小鼠模型中验证PI3Kβ抑制剂的血脑屏障穿透效率。