RNA-seq分析之最佳cutoff（TCGA版）

陈天白2025-09-25 9:36

原理是依据生存数据来区分基因高低表达的阈值，用来判别基因高表达组和低表达组挺好用的，还有个数据库专门做这个PrognoScan: A new database for meta-analysis of the prognostic value of genes.

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# ZNF503基因表达与生存分析完整流程
# 本代码用于分析ZNF503基因表达水平与患者生存率之间的关系

# ----------------------------
# 1. 加载所需的R包
# ----------------------------
# 如果尚未安装这些包，请先运行安装命令
# install.packages(c("jsonlite", "tidyr", "dplyr", "survival", "survminer", "ggplot2"))

# 用于处理JSON格式数据
library(jsonlite)
# 用于数据处理和清洗
library(tidyr)
library(dplyr)
# 用于生存分析
library(survival)
# 用于生存分析可视化
library(survminer)
# 用于数据可视化
library(ggplot2)

# ----------------------------
# 2. 读取和准备数据
# ----------------------------

# 读取基因表达数据（FPKM矩阵）
# check.names = F 确保列名不会被自动修改
exprSet <- read.table("G:/冷热肿瘤/data/数据清洗/fpkm_Matrix.txt", check.names = F)

# 读取临床数据（JSON格式）
clinical_json <- jsonlite::fromJSON('G:/冷热肿瘤/data/clinical.cart.2025-01-03.json')

# 提取人口统计学信息并转换为数据框
demographic_data <- as.data.frame(clinical_json$demographic)

# 选择需要的临床特征列
# 3:性别, 5:死亡状态, 7:出生日期(天数), 9:随访时间
demographic_data <- demographic_data[, c(3, 5, 7, 9)]

# 计算年龄（取绝对值，因为天数通常以负数表示）
demographic_data$days_to_birth <- abs(demographic_data$days_to_birth)

# 重命名列名，使其更直观
colnames(demographic_data)[1:4] <- c("sex", "fustat", "age", "futime")

# 提取临床数据中的样本ID信息
clinical_samples <- clinical_json[, 4]

# 将样本ID与人口统计学数据合并
clinical <- cbind(clinical_samples, demographic_data)

# 重命名第一列为"id"，便于后续合并
colnames(clinical)[1] <- "id"

# ----------------------------
# 3. 处理样本ID，区分肿瘤和正常样本
# ----------------------------

# 从基因表达数据的列名（样本ID）中提取信息
# TCGA的样本ID格式通常为：TCGA-XX-XXXX-XXX-XXX，我们需要拆分它
condition_table <- tidyr::separate(
  data = data.frame('ids' = colnames(exprSet)),
  col = 'ids',
  sep = '-',
  into = c('c1', 'c2', 'c3', 'c4', 'c5', 'c6', 'c7')
)

# 将原始样本ID与拆分后的信息合并
condition_table <- cbind(
  'ids' = colnames(exprSet), 
  condition_table,
  # 提取前12个字符作为submitter_ID（用于匹配临床数据）
  'submitter_IDs' = substr(colnames(exprSet), 1, 12)
)

# 根据TCGA ID规则，c4字段的前三位表示样本类型
# 0开头的通常是肿瘤样本，1开头的通常是正常样本
condition_table$c4 <- gsub(condition_table$c4, pattern = '^0..', replacement = 'cancer')
condition_table$c4 <- gsub(condition_table$c4, pattern = '^1..', replacement = 'normal')

# 选择需要的列并重新命名
condition_table <- condition_table[, c('ids', 'c4', 'submitter_IDs')]
names(condition_table) <- c('sample', 'group', 'submitter_id')

# 确保ID列是字符型，避免后续匹配出错
condition_table$submitter_id <- as.character(condition_table$submitter_id)
condition_table$sample <- as.character(condition_table$sample)

# 保存处理好的样本信息，方便以后复用
save(condition_table, file = 'condition_table.rdata')

# ----------------------------
# 4. 合并临床数据和基因表达数据
# ----------------------------

# 重命名列名，使两个数据框有相同的键用于合并
colnames(condition_table)[3] <- "id"

# 通过id列合并样本信息和临床数据
clinical <- condition_table %>% left_join(clinical, by = "id")

# 保存合并后的临床数据
write.table(
  clinical, 
  file = "G:/冷热肿瘤/data/数据清洗/clinical.txt", 
  sep = "\t", 
  row.names = TRUE, 
  col.names = TRUE, 
  quote = FALSE
)

# 重新读取保存的临床数据，确保格式正确
clinical <- read.table(
  "G:/冷热肿瘤/data/数据清洗/clinical.txt",
  sep = "\t",
  row.names = TRUE, 
  header = TRUE
)

# 确保样本名是字符型，便于后续匹配
clinical$sample <- as.character(clinical$sample)
colnames(exprSet) <- as.character(colnames(exprSet))

# ----------------------------
# 5. 提取ZNF503基因的表达值
# ----------------------------

# 创建新列存储ZNF503的表达值，先初始化为NA
clinical$ZNF503expression <- NA

# 循环匹配样本，将对应的ZNF503表达值填入临床数据
for (i in 1:nrow(clinical)) {
  # 获取当前样本名
  sample_name <- clinical$sample[i]
  
  # 检查样本是否在表达数据中存在
  if (sample_name %in% colnames(exprSet)) {
    # 将表达数据中ZNF503基因对应样本的值赋给临床数据
    clinical$ZNF503expression[i] <- exprSet["ZNF503", sample_name]
  }
}

# 查看前几行数据，确认ZNF503表达值已正确添加
head(clinical)

# ----------------------------
# 6. 准备生存分析数据
# ----------------------------

# 处理生存状态：Alive(存活)设为0，Dead(死亡)设为1
clinical$fustat <- ifelse(clinical$fustat == "Alive", 0, 1)

# 查看处理后的生存状态
head(clinical$fustat)

# 去除含有缺失值的行（生存分析不能有缺失值）
clinical <- clinical[complete.cases(clinical[, c("futime", "fustat", "ZNF503expression")]), ]

# 按ZNF503表达值从小到大排序
cli <- clinical[order(clinical$ZNF503expression), ]
rownames(cli) <- cli$sample

# ----------------------------
# 7. 寻找最佳的高低表达分组阈值
# ----------------------------

# 初始化存储P值和HR值的向量
pvals <- c()
hrs <- c()

# 尝试不同的分组点，从第1个样本到倒数第1个样本
for(n in 1:(nrow(cli)-1)) {
  # 将样本分为两组：前n个为低表达，其余为高表达
  ssdf <- cbind(
    cli,
    data.frame(type = rep(c("ZNF503Low", "ZNF503High"), c(n, nrow(cli)-n)))
  )
  
  # 将分组设为因子型变量
  ssdf$type <- factor(ssdf$type, levels = c("ZNF503Low", "ZNF503High"))
  
  # 进行生存差异分析
  fitd <- survdiff(
    Surv(futime, fustat) ~ type,  # 生存时间和状态 ~ 分组
    data = ssdf,
    na.action = na.exclude  # 排除缺失值
  )
  
  # 计算P值
  pValue <- 1 - pchisq(fitd$chisq, length(fitd$n) - 1)
  pvals <- c(pvals, pValue)
  
  # 计算风险比(HR)
  hr <- (fitd$obs[1] / fitd$exp[1]) / (fitd$obs[2] / fitd$exp[2])
  hrs <- c(hrs, hr)
}

# 将结果整理成数据框
dat <- data.frame(
  Num = 1:(nrow(cli)-1),  # 分组点位置
  HR = hrs,               # 风险比
  Pvalue = pvals          # P值
)

# 查看结果的前几行
head(dat)

# ----------------------------
# 8. 可视化不同分组点的结果
# ----------------------------

# 绘制HR和P值的关系图
ggplot(dat, aes(x = log2(HR), y = -log10(Pvalue))) + 
  geom_point(shape = 21, aes(fill = Num), size = 3) +  # 点的大小和形状
  scale_fill_continuous(name = "分组点位置") +  # 颜色图例
  geom_vline(xintercept = c(-1, 1), linetype = "dashed", color = "gray50") +  # 参考线
  geom_hline(yintercept = (-log10(0.05)), linetype = "dashed", color = "gray50") +  # 显著性阈值线
  labs(
    x = "log2(HR)", 
    y = "-log10(P值)",
    title = "不同分组点的生存分析结果"
  ) +
  theme_bw() +  # 白色背景主题
  theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5))  # 标题居中

# ----------------------------
# 9. 确定最佳分组并进行最终生存分析
# ----------------------------

# 找到P值最小的分组点（最佳分组）
bestNum <- dat$Num[which.min(pvals)]
cat("最佳分组点位置：", bestNum, "\n")

# 根据最佳分组点创建分组
ssdf2 <- cbind(
  cli,
  data.frame(type = rep(c("ZNF503Low", "ZNF503High"), c(bestNum, nrow(cli)-bestNum)))
)

# 设置分组因子水平
ssdf2$type <- factor(ssdf2$type, levels = c("ZNF503Low", "ZNF503High"))

# 查看两组的样本数量
cat("分组样本数量：\n")
print(table(ssdf2$type))

# 进行生存差异分析
fitd2 <- survdiff(
  Surv(futime, fustat) ~ type,
  data = ssdf2,
  na.action = na.exclude
)
print(fitd2)

# 计算最终P值
pValue2 <- 1 - pchisq(fitd2$chisq, length(fitd2$n) - 1)
cat("生存差异P值：", pValue2, "\n")

# 格式化P值标签
p.lab2 <- paste0("P", ifelse(pValue2 < 0.001, " < 0.001", paste0(" = ", round(pValue2, 3))))

# 拟合生存曲线模型
fit2 <- survfit(Surv(futime, fustat) ~ type, data = ssdf2)

# 保存分组结果
write.csv(ssdf2, file = "G:/ZNF503/RNA-seq/生存分析/group.csv", row.names = FALSE)

# ----------------------------
# 10. 计算HR值和95%置信区间
# ----------------------------

# 使用Cox比例风险模型计算HR
cox.obj <- coxph(Surv(futime, fustat) ~ type, data = ssdf2, na.action = na.exclude)
cox.sum <- summary(cox.obj)

# 提取HR值和95%置信区间
HR <- round(exp(cox.sum$coef[1]), 2)
HR.ci <- round(exp(confint(cox.obj))[1, ], 2)
hr.lab <- paste0("HR = ", HR, " (95% CI: ", HR.ci[1], "-", HR.ci[2], ")")
cat("风险比(HR)：", HR, "，95%置信区间：", HR.ci[1], "-", HR.ci[2], "\n")

# ----------------------------
# 11. 绘制最终的生存曲线
# ----------------------------

# 创建生存曲线
g <- ggsurvplot(
  fit2,                  # 生存分析结果
  data = ssdf2,          # 数据
  conf.int = TRUE,       # 显示置信区间
  pval = p.lab2,         # 显示P值
  pval.size = 5,         # P值字体大小
  pval.coord = c(0, 0.2),# P值位置
  palette = c("#377EB8", "#E41A1C"),  # 曲线颜色
  legend.title = "ZNF503表达水平",  # 图例标题
  legend.labs = c("低表达", "高表达"),  # 图例标签
  legend = "right",      # 图例位置
  legend.linetype = FALSE,
  surv.median.line = "hv",  # 显示中位生存时间线
  xlab = "时间 (天)",    # X轴标签
  ylab = "生存率",       # Y轴标签
  risk.table = TRUE,     # 显示风险人数表
  risk.table.col = "strata",  # 风险表按分组着色
  risk.table.height = 0.25,   # 风险表高度
  ggtheme = theme_bw(base_size = 14)  # 图表主题
)

# 添加HR值到生存曲线图
g$plot <- g$plot +
  annotate("text",
           x = 0, y = 0.15,  # 文本位置
           label = hr.lab,   # 文本内容
           hjust = 0,        # 水平对齐方式
           size = 4.5)       # 文本大小

# 显示生存曲线
print(g)

# 保存生存曲线为PDF文件
ggsave(
  filename = "ZNF503生存曲线.pdf",
  plot = g,
  width = 10,
  height = 8,
  device = "pdf"
)
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