Alphafold实用指南—官网教程3

承接上一篇博客：https://blog.csdn.net/weixin_62528784/article/details/155135250?spm=1001.2014.3001.5502

本篇博客主要是我参与学习EMBL-EBI关于Alphafold培训课程的最后一篇笔记，

官网相关教程信息，参考：https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/alphafold/

最后也是完整结束了整个培训课程！

文章目录

[一，AlphaFold 3 和 AlphaFold 服务器](#一，AlphaFold 3 和 AlphaFold 服务器)
- [1，介绍 AlphaFold 3](#1，介绍 AlphaFold 3)
- - [扩展 AlphaFold 的应用范围](#扩展 AlphaFold 的应用范围)
  - [AlphaFold 3 输入概述](#AlphaFold 3 输入概述)
  - 如何访问AlphaFold3？
- [2，AlphaFold 3 是如何工作的？](#2，AlphaFold 3 是如何工作的？)
- - [Tokenisation 分词](#Tokenisation 分词)
  - [Diffusion 扩散](#Diffusion 扩散)
  - [AlphaFold 3 输出概述](#AlphaFold 3 输出概述)
- [3，AlphaFold 3 面临的问题](#3，AlphaFold 3 面临的问题)
- [4，我应该使用 AlphaFold 2 还是 AlphaFold 3？](#4，我应该使用 AlphaFold 2 还是 AlphaFold 3？)
- [5，AlphaFold 3 的预测结果是如何得到验证的？](#5，AlphaFold 3 的预测结果是如何得到验证的？)
- - 替代方案的出现
  - [AlphaFold 3 的独立基准测试](#AlphaFold 3 的独立基准测试)
  - 新一代预测工具
- [6，AlphaFold 服务器：通往 AlphaFold 3 的入口](#6，AlphaFold 服务器：通往 AlphaFold 3 的入口)
- - [AlphaFold Server 能做什么？](#AlphaFold Server 能做什么？)
  - [AlphaFold Server 不能做什么？](#AlphaFold Server 不能做什么？)
- [7，使用 AlphaFold Server 生成预测结果的逐步指南](#7，使用 AlphaFold Server 生成预测结果的逐步指南)
- - 添加复合物
  - 添加修饰
  - 任务提交
  - 结果
- [8，AlphaFold Server 的高级功能](#8，AlphaFold Server 的高级功能)
- - [JSON 任务提交](#JSON 任务提交)
  - 采样多个种子
  - 复现任务（seed）
- [9，解读AlphaFold Server输出的结果](#9，解读AlphaFold Server输出的结果)
- - [AlphaFold Server 提供的输出](#AlphaFold Server 提供的输出)
  - 置信度指标
- [10，如何评估 AlphaFold 3 预测的质量](#10，如何评估 AlphaFold 3 预测的质量)
- - [AlphaFold 3 中的 pLDDT 分数](#AlphaFold 3 中的 pLDDT 分数)
  - [AlphaFold 3 中的 PAE 分数](#AlphaFold 3 中的 PAE 分数)
  - [pTM 和 ipTM，每链评分和成对评分](#pTM 和 ipTM，每链评分和成对评分)
- [11，使用 AlphaFold 3 源代码](#11，使用 AlphaFold 3 源代码)
- - 初始结构预测的注意事项
  - [AlphaFold 3 输入格式](#AlphaFold 3 输入格式)
  - [与 AlphaFold Server JSON 兼容](#与 AlphaFold Server JSON 兼容)
  - 特殊考虑
- 12，总结
- - 错义变异效应的预测
- 13，课程ppt下载
二，术语表

一，AlphaFold 3 和 AlphaFold 服务器

现在，我们终于来到了AlphaFold3，前面讲了那么多的AlphaFold2系列工具以及工作。

从本节开始，我们需要掌握一定的AlphaFold2前置知识，也就是前面我两篇博客记录的笔记。

包括对置信度分数、优势及局限性的理解，以及对底层技术的掌握，因为AlphaFold2和3底层的东西是一样的。

同样的，本节培训的目标如下：

1，介绍 AlphaFold 3

扩展 AlphaFold 的应用范围

官网所给出的这几个例子，都是前面AlphaFold2时代局限性，但是我们又不得不考虑并且更新迭代完善所需要的功能，

比如说前面multimer才能做的复合物建模，现在我们3也能做了，我们会考虑蛋白质和DNA等非常复杂的互作关系。

还有化学修饰，比如说是在蛋白质中非常广泛的翻译后修饰。

统一泛化的AlphaFold3。

还有一个RNA结构预测建模的问题：

官网培训教程给出的一些例子：在多模态分子结构建模方面（核酸、蛋白质模态）

抗原-抗体-糖的超大复合物：

还有配体的模拟：

AlphaFold 3 输入概述

关于化学成分词典，参考PDB官网：https://www.wwpdb.org/data/ccd

我在之前的博客<如何批量提交AlphaFold3 web server json服务>中提到过这个标准，

https://blog.csdn.net/weixin_62528784/article/details/154954399?spm=1001.2014.3001.5502

如何访问AlphaFold3？

其中github仓库网址参考：https://github.com/google-deepmind/alphafold3

使用需求参考：https://github.com/google-deepmind/alphafold3/blob/main/WEIGHTS_TERMS_OF_USE.md

2，AlphaFold 3 是如何工作的？

更正：AlphaFold3还是保留了MSA多序列比对部分的信息，以及模块处理

Tokenisation 分词

这里有一个重点需要强调，AlphaFold3中PAE图是针对token进行计算，而不是2中针对氨基酸参加进行。

Diffusion 扩散

AlphaFold 3 输出概述

网页服务器给出的5个model，其实就是5次采样扩散过程的结果；

另外指标这一方面：

pLDDT依旧是对于局部（原子）位置预测的置信指标，PAE是相对位置预测置信，

pTM依旧是对整体，ipTM是复合物角度的PAE，

**再次强项AlphaFold3和2的区别：

**AlphaFold 3 预测复杂结构中单个原子的坐标，这与 AlphaFold 2 不同，AlphaFold 2 预测的是氨基酸残基及其侧链的位置。

3，AlphaFold 3 面临的问题

PDB中静态结构，也就是缺少结构变异性，也就是无法捕捉多构象集合性质；

这一点其实我在前一篇博客中提到了，问题本质其实就是机器学习的通病，学到的是训练集的分布规律，多多少少对训练集有bias。

官网给出的一个非常典型的例子：

model的幻觉，我们依然是能够从pLDDT置信度的指标上看出来的，

但是预测的结构，其实是难以预估的。

4，我应该使用 AlphaFold 2 还是 AlphaFold 3？

这其实是一个非常重要的问题：

对于复合物的建模，需要考虑非聚合物环境也就是上下文context的影响，

尤其是我们在正常建模特定配以有无时的聚合物结构时，很容易一不小心就将必要的稳定化配体当做case-control都去掉。

这里举一个例子------在使用AlphaFold 3预测锌指蛋白与DNA转录因子结合序列的互作结构时，锌离子作为非聚合物配体，其加入或移除会对聚合物的置信度评分产生显著影响：

AlphaFold 3的工作原理与置信度评分机制：AlphaFold 3的置信度评分是针对标记计算的，这使其能够预测包含多种分子类型的异质复合物。其置信度指标包括pLDDT、PTM、iPTM、成对iPTM和亚基间接触的PAE等，这些指标反映了预测结构的可靠性和相互作用的置信度。
锌离子对蛋白质-DNA互作结构的影响：锌指蛋白的结构和功能依赖于锌离子的存在，锌离子与锌指蛋白中的特定氨基酸残基结合，稳定其三维结构，进而影响锌指蛋白与DNA的结合模式和亲和力。如果在预测时不加入锌离子，AlphaFold 3可能无法准确捕捉到锌指蛋白的正确构象，以及其与DNA相互作用的精确方式，从而导致置信度评分降低。
非聚合物环境对置信度评分的影响：根据AlphaFold 3的特性，非聚合物环境如锌离子等配体的加入或移除，会改变复合物的整体能量状态和分子间相互作用，进而影响模型对结构预测的置信度。在锌指蛋白与DNA互作的例子中，锌离子作为稳定配体，其存在与否会影响蛋白质-DNA界面的结构稳定性和相互作用强度，AlphaFold 3会根据这些变化调整置信度评分。
与AlphaFold 2的比较：AlphaFold 2主要针对蛋白质结构预测，不考虑非聚合物环境的影响，因此在预测蛋白质-DNA互作时，无需考虑锌离子等配体的加入或移除问题。但这也可能导致其在预测包含非聚合物成分的复合物结构时，结构准确性略低于AlphaFold 3，不过避免了因非聚合物环境因素带来的置信度评分复杂性。

总的来说：

AlphaFold 3对聚合物（如蛋白质）的置信度评分，会受"非聚合物环境"（如离子、稳定配体等）的显著影响------加入或移除这类物质，可能大幅改变评分结果。

若要在"仅含聚合物"的场景（如研究蛋白质-蛋白质相互作用）中使用它，需根据情况适当添加非聚合物环境，才能让置信度评分更可靠。AlphaFold 2无需考虑"非聚合物环境"的影响，能避开上述操作复杂性，但代价可能是其预测的结构准确度会略低于AlphaFold 3。

5，AlphaFold 3 的预测结果是如何得到验证的？

替代方案的出现

HelixFold-3，参考：https://github.com/PaddlePaddle/PaddleHelix

Chai-1：参考https://github.com/chaidiscovery/chai-lab

Boltz-1 and Boltz-2：参考https://github.com/jwohlwend/boltz

Protenix：参考https://github.com/bytedance/Protenix

AlphaFold 3 的独立基准测试

当然，也有一些阴性结果报道：

一个核心优势，就是静态相互作用预测表现突出。

AF3 在预测 "静态蛋白质 - 配体相互作用" 时表现优异 ------ 这类相互作用的特点是，蛋白质与配体结合后，自身构象变化极小（蛋白质与未结合配体时的 "去蛋白状态" 相比，RMSD 值＜0.5Å，RMSD 是衡量分子结构相似性的关键指标，数值越小表示构象差异越小）。

在该场景下，AF3 显著优于传统对接方法，尤其在 "侧链取向准确性" 上优势明显，还能作为 "真阳性二元相互作用建模工具"，为经实验验证的结合对生成可靠的结构模型，这对药物研发中确认有效结合关系有实际价值。

不过这种类似于刚性对接的静态互作场景毕竟是比较少见的，谁也不能够保证，尤其直觉或者常理来说如果一个蛋白质要和一个配体进行互作，其构象应该会发生比较大的变化，比如说酶的活性位点附近的构象，应该会发生比较大的构象变化。

一个基准测试，有点意思，参考：https://github.com/BEAM-Labs/FoldBench

名为 FoldBench 的系统性评测上线，全面评估了当前全原子预测模型在生物分子结构预测中的表现。该研究由复旦大学、上海交通大学、香港中文大学等机构的科研人员联合完成，评估对象包括DeepMind最新发布的 AlphaFold 3 以及其他四款全原子预测模型。

新一代预测工具

主要是ABCFold和AlphaBridge。

6，AlphaFold 服务器：通往 AlphaFold 3 的入口

AlphaFold Server 能做什么？

我们可以使用 AlphaFold Server 对由以下一种或多种生物分子组成的结构进行建模：

AlphaFold Server 不能做什么？

关于配额，以及任务提交的问题，

7，使用 AlphaFold Server 生成预测结果的逐步指南

这一小节其实就很直白了，基本上就是网页端的操作简单指南：

官网也给出了一个教程，具体视频地址在油管上：
https://youtu.be/9ufplEgtq8w

具体的输入操作非常简单：

添加复合物

其实就是多聚物中单体的拷贝数，也就是副本数目

添加修饰

翻译后最是非常简单，网页端只需要在添加实体entity也就是蛋白质序列链中点击所需要修饰的氨基酸残基即可，

然后再选对应类型，

基本上就是选残基（position）+选类型（type）这两步，

如果是json设置的话，就是一个entity中的两个键值对，具体可以参考我之前批量提交网页服务的博客：

https://blog.csdn.net/weixin_62528784/article/details/154954399?spm=1001.2014.3001.5502

对于核酸其实同理，但是我们知道像DNA这样的双链结构，其实修饰是有区别的，

所以一般的修饰还是要看你是在哪一条链上的。

建模顺序和排列顺序之间，实际的排列顺序影响不大：

任务提交

结果

8，AlphaFold Server 的高级功能

JSON 任务提交

这个其实我之前的博客就提到过了，具体参考：https://blog.csdn.net/weixin_62528784/article/details/154954399?spm=1001.2014.3001.5502

采样多个种子

这一点也很重要，采样嘛，基本上就是奔着结构预测效果提升，或者是看更多的构象去的，

官方是建议：采用起码20个左右的种子（也就是一个任务每次采用不同的种子，起码运行20次），这样的采样潜在空间基本上够用，然后再依据前面提到过的各种评估置信指标值，对预测结果进行评估，主要是排序。

当然，我们知道每一个seed种子的任务，其实是有5个model输出的，也就是有5次采样扩散过程的结果。

复现任务（seed）

其实就是预测结果的可重复性，以及你最后提交，比如说是文献的时候一个依据凭证，

简单来说：就是保留你每次运行任务的json文件，这个文件很重要，甚至是可以作为文献发表中的附近资料。

9，解读AlphaFold Server输出的结果

这一点其实很重要，因为我看到太多的人，主要是做湿实验、也就是纯生物那一批人，基本山只看最后结构的交互图，要么截一下图示意一下，PAE都很少看；有点意识的会把mmCIF文件下载回去之后在pymol等可视化软件中进查看；至于指标，其实很多人并不是很关注。

但是，这些也仅仅只是表面信息，

真正有用的信息，

AlphaFold Server 提供的输出

比如说我这里的一个结构预测的job的输出，

大致上就有下面这些文件：

full data数据比较多，文件比较大，其中键值对内容主要参考下图中文件右上角：

这一部分信息比较杂，

request就没什么好说了，其实就是对任务job的描述：

至于model的cif文件，其实就是预测结果的结构坐标文件

然后就是置信指标的summary文件：

具体有哪些指标，可以看下图右上角的键值对信息

term of use的话就是一堆废话

再次强调，每个种子有5次扩散采样，但是前面提到的种子扩展需要至少20个左右的种子seed；

5个model，有个排名rank，主要是对结构进行的置信排名，从前面我们可以知道，主要是对pTM以及ipTM等指标的综合考虑

下面就是一个fold__summary_confidences_.json文件内容的示例，展示了多个置信度指标。

plain 复制代码

{
 "chain_iptm": [
  0.85,
  0.86,
  0.59,
  0.59
 ],
 "chain_pair_iptm": [
  [
   0.82,
   0.9,
   0.83,
   0.83
  ],
  [
   0.9,
   0.82,
   0.83,
   0.84
  ],
  [
   0.83,
   0.83,
   0.03,
   0.1
  ],
  [
   0.83,
   0.84,
   0.1,
   0.03
  ]
 ],
 "chain_pair_pae_min": [
  [
   0.76,
   0.79,
   1.0,
   1.12
  ],
  [
   0.79,
   0.76,
   1.11,
   1.0
  ],
  [
   0.98,
   1.06,
   0.78,
   0.92
  ],
  [
   1.05,
   0.97,
   0.92,
   0.78
  ]
 ],
 "chain_ptm": [
  0.82,
  0.82,
  0.03,
  0.03
 ],
 "fraction_disordered": 0.18,
 "has_clash": 0.0,
 "iptm": 0.91,
 "num_recycles": 10.0,
 "ptm": 0.91,
 "ranking_score": 1.0
}