一、研究背景与目的
本报告汇总了多篇已发表文献中关于 Anti-mouse PD-1 mAb (Clone RMP1-14) 和 Axitinib 在小鼠肿瘤模型中的使用方法、剂量、给药周期及实验结果分析。涵盖的肿瘤模型包括肾细胞癌（RenCa）、黑色素瘤（B16F10、YUMM）、结直肠癌（MC38、CT26）等，旨在为研究者提供全面的实验设计参考。
二、Anti-mouse PD-1 mAb (Clone RMP1-14) 使用方案汇总
2.1 基本信息
- 克隆号：RMP1-14
- 同型：Rat IgG2a, κ
- 靶点：小鼠PD-1 (CD279)
- 作用机制：阻断PD-1与PD-L1/PD-L2的结合，解除T细胞免疫抑制
- 供应商：Bio X Cell (West Lebanon, NH, USA)，货号 BE0146
2.2 不同文献中的给药方案对比
| 文献来源 | 肿瘤模型 | 单次剂量 | 给药途径 | 频率 | 总次数 | 给药时机 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Watanabe et al., 2023 (RenCa) | RenCa肾细胞癌 | 200 μg/只 | i.p. | 每周2次 | 4次 | 肿瘤~100 mm³开始 |
| Watanabe et al., 2023 (序贯) | RenCa肾细胞癌 | 200 μg/只 | i.p. | 每周4次 | 4次 | 第1周或第2周 |
| FBPA PET研究, 2022 | B16F10黑色素瘤 | 250 μg/只 | i.p. | 2次 | 2次 | Day 0, Day 5 |
| Shp-1研究, 2024 | YUMM黑色素瘤 | 250 μg/只 | i.p. | 每3天 | 多次 | 肿瘤可见开始 |
| DDR1 CRISPR, 2024 | MC38/CT26结肠癌 | 10 mg/kg (~200 μg/只) | i.p. | 每3天 | 4次 | 肿瘤接种后7天 |
| 靶向治疗后免疫, 2022 | SM1黑色素瘤 | 200 μg/只 | i.p. | 每5天 | 2次 | 肿瘤~50 mm³开始 |
| PD-1耐药模型, 2022 | MC38结肠癌 | 12.5 mg/kg/周 | i.p. | 每周1次 | 多次 | 肿瘤~150 mm³开始 |
2.3 推荐标准方案
| 参数 | 推荐值 | 适用范围 |
|---|---|---|
| 单次剂量 | 200--250 μg/ 只 | 大多数肿瘤模型 |
| 换算剂量 | 10--12.5 mg/kg | 按20g小鼠计算 |
| 给药途径 | 腹腔注射 (i.p.) | 标准方法 |
| 给药频率 | 每 3--5 天一次 | 根据实验周期调整 |
| 总给药次数 | 4--6 次 | 2--3周实验周期 |
| 溶剂 | PBS 或生理盐水 | --- |
| 配制体积 | 100--200 μL/ 只 | --- |
2.4 对照设置
- 同型对照：Rat IgG2a κ Isotype Control（MOPC-21, BE0083 或 2A3, BE0089）
- 剂量：与实验组一致（200--250 μg/只）
- 溶剂对照：PBS或生理盐水
三、Axitinib 使用方案汇总
3.1 基本信息
- CAS 号：319460-85-0
- 分子式：C22H18N4OS
- 分子量：386.47 g/mol
- 作用靶点：VEGFR-1/2/3（酪氨酸激酶抑制剂）
- 作用机制：抑制肿瘤血管生成，同时可上调PD-L1表达
3.2 不同文献中的给药方案对比
| 文献来源 | 肿瘤模型 | 单次剂量 | 给药途径 | 频率 | 周期 | 溶剂/载体 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Watanabe et al., 2023 | RenCa肾细胞癌 | 25 mg/kg | p.o. | 隔日 | 2周 | 含3 mM HCl蒸馏水 |
| Watanabe et al., 2023 (序贯) | RenCa肾细胞癌 | 25 mg/kg | p.o. | 每日 | 1周 | 含3 mM HCl蒸馏水 |
| 胶质瘤研究, 2019 | 005 GSC胶质瘤 | 25 mg/kg | i.p. | 5天给药/2天停药 | 3周期 | 未说明 |
| 786-O肾癌, 2022 | 786-O肾癌 | 30--60 mg/kg | p.o. | 每日2次 | 15天 | 0.5% CMC-Na |
| 血管通透性, 2022 | C57BL/6正常小鼠 | 10 mg/kg | p.o. | 单次 | --- | CMC-Na |
| 靶向治疗后免疫, 2022 | SM1黑色素瘤 | 25 mg/kg | p.o. | 每日 | 持续 | 0.5% CMC + 0.1% Tween 80 |
3.3 推荐标准方案
| 参数 | 推荐值 | 备注 |
|---|---|---|
| 单次剂量 | 25 mg/kg | 文献最常用剂量 |
| 剂量范围 | 10--60 mg/kg | 根据模型调整 |
| 给药途径 | 口服灌胃 (p.o.) | 标准方法 |
| 给药频率 | 隔日一次或每日一次 | --- |
| 给药周期 | 2--3 周 | 根据实验需求 |
| 溶剂方案 A | 含 3 mM HCl 的蒸馏水 | 超声助溶，现配现用 |
| 溶剂方案 B | 0.5% CMC-Na | 羧甲基纤维素钠混悬 |
| 溶剂方案 C | 0.5% CMC + 0.1% Tween 80 | 提高溶解度 |
3.4 配制方法详解
方案A：酸性水溶液（Watanabe et al.方法）
- 称量Axitinib粉末
- 溶于含3 mM HCl的蒸馏水中
- 超声处理10--15分钟助溶
- 现配现用，或分装后-20°C保存
方案B：CMC-Na混悬液（786-O肾癌模型方法）
- 配制0.5% CMC-Na水溶液
- 加入Axitinib粉末
- 超声或涡旋混匀
- 口服灌胃给药
方案C：CMC/Tween混合液（靶向治疗后免疫研究方法）
- 配制0.5%羧甲基纤维素 + 0.1% Tween 80水溶液
- 加入Axitinib粉末
- 充分混匀至均匀混悬
- 口服灌胃给药
四、联合用药方案设计
4.1 同时给药方案（标准联合）
| 药物 | 剂量 | 途径 | 频率 | 周期 |
|---|---|---|---|---|
| Anti-PD-1 (RMP1-14) | 200 μg/只 | i.p. | 每周2次 | 2周 |
| Axitinib | 25 mg/kg | p.o. | 隔日 | 2周 |
4.2 序贯给药方案（时序对比研究）
方案A：ICI先行
- 第 1 周：Anti-PD-1 200 μg, i.p., 每周4次
- 第 2 周：Axitinib 25 mg/kg, p.o., 每日
方案B：TKI先行
- 第 1 周：Axitinib 25 mg/kg, p.o., 每日
- 第 2 周：Anti-PD-1 200 μg, i.p., 每周4次
方案C：同时给药
- 全程：Anti-PD-1 200 μg, i.p., 每周2次 + Axitinib 25 mg/kg, p.o., 隔日
4.3 联合用药实验设计（Watanabe et al., 2023）
| 实验 | 组别数 | 分组设计 |
|---|---|---|
| 实验一 | 6组 | 对照、Axitinib单药、Anti-PD-1单药、Anti-PD-L1单药、Axitinib+Anti-PD-1、Axitinib+Anti-PD-L1 |
| 实验二 | 7组 | 对照、同时给药(Axi+PD-1)、Axi先→PD-1后、PD-1先→Axi后、同时给药(Axi+PD-L1)、Axi先→PD-L1后、PD-L1先→Axi后 |
五、肿瘤模型建立方法汇总
5.1 皮下移植瘤模型
| 肿瘤类型 | 细胞系 | 细胞量 | 混悬液 | 接种部位 | 成瘤时间 | 给药时机 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 肾细胞癌 | RenCa | 5×10⁶ | PBS + Matrigel | 左侧flank | ~7天 | ~100 mm³ |
| 黑色素瘤 | B16F10 | 3×10⁶ | PBS | 皮下 | ~3天 | Day 0 |
| 黑色素瘤 | YUMM | 5×10⁵ | PBS | 右后肢flank | 肿瘤可见 | 肿瘤可见时 |
| 结肠癌 | MC38 | 1×10⁴ | --- | C57BL/6小鼠 | ~7天 | ~150 mm³ |
| 结肠癌 | CT26 | 1×10⁴ | --- | BALB/c小鼠 | ~7天 | ~150 mm³ |
| 胶质瘤 | 005 GSC | 2×10⁴ | --- | 原位(脑内) | --- | Day 12 |
5.2 静脉转移模型
| 肿瘤类型 | 细胞系 | 细胞量 | 途径 | 观察指标 | 终点 |
|---|---|---|---|---|---|
| 肾细胞癌 | RenCa | 5×10⁶ | 尾静脉 | 生存期 | 24天或死亡 |
5.3 肿瘤体积计算公式
- 标准公式：V = 1/2 × (短径)² × 长径
- 替代公式：V = 0.5 × 长径 × (短径)²
- 球体公式：V = 4/3 × π × r³ (用于正位模型)
六、实验结果分析汇总
6.1 单药 vs 联合用药（Watanabe et al., RenCa模型）
| 组别 | 21天肿瘤抑制率 | 显著性 | 生存期延长 |
|---|---|---|---|
| Axitinib单药 | -23.9% | 不显著 | 显著 |
| Anti-PD-1单药 | -11.8% | 不显著 | 不显著 |
| Anti-PD-L1单药 | -27.8% | 不显著 | 不显著 |
| Axitinib + Anti-PD-1 | -50.6% | p < 0.05 | 显著 |
| Axitinib + Anti-PD-L1 | -42.2% | p < 0.05 | 显著 |
6.2 序贯给药时序对比（核心发现）
| 方案 | 21天肿瘤抑制率 | 生存期 | CD8/CD3比值 | CD8/CD11b比值 |
|---|---|---|---|---|
| 同时给药 | -75.8% | 显著延长 | ↑↑显著升高 | ↑↑显著升高 |
| ICI 先行 | -76.7% | 显著延长 | ↑↑显著升高 | ↑↑显著升高 |
| TKI先行 | -49.5% | 不显著 | 无变化 | 无变化 |
关键结论 ： 1. ICI 先行或同时给药 效果最佳（~76%抑制率） 2. TKI 先行效果最差，甚至不显著 3. 免疫微环境指标（CD8/CD3、CD8/CD11b）与疗效正相关
6.3 其他文献中的联合用药结果
| 文献 | 模型 | 联合方案 | 主要结果 |
|---|---|---|---|
| 胶质瘤研究, 2019 | 005 GSC | Axitinib + G47Δ-mIL12 | 显著延长生存期，免疫 competent小鼠有效 |
| 靶向治疗后免疫, 2022 | SM1黑色素瘤 | Anti-PD-1 → Ceritinib/Trametinib | 靶向治疗后免疫维持持久应答 |
| DDR1 CRISPR, 2024 | MC38/CT26 | DDR1抑制剂 + RMP1-14 | DDR1抑制增强PD-1疗效 |
七、药代动力学参考
7.1 RMP1-14在小鼠体内的PK参数
| 参数 | 数值 | 备注 |
|---|---|---|
| 检测方法 | LC-MS/MS | 特征肽GFYPPDIYTEWK |
| 线性范围 | 0.5--50.0 μg/mL | --- |
| 半衰期 | 约3--5天 | 大鼠IgG2a在小鼠体内 |
| 剂量依赖性 | 是 | 2.5 mg/kg vs 7.5 mg/kg |
7.2 Axitinib药代动力学特点
| 参数 | 数值 | 备注 |
|---|---|---|
| 口服生物利用度 | ~58%（人） | 小鼠推测30--50% |
| 半衰期 | 2.5--6.1 h（人） | 小鼠约2--5 h |
| Cmax时间 | 1--2 h（空腹） | 口服后 |
| 血浆蛋白结合率 | >99% | 主要结合白蛋白 |
| 代谢酶 | CYP3A4, CYP1A2, CYP2C19 | 肝脏代谢 |
八、实验操作要点
8.1 试剂储存与配制
| 试剂 | 储存条件 | 复溶/配制 | 稳定性 |
|---|---|---|---|
| RMP1-14 | -80°C，分装 | PBS或生理盐水复溶 | 4°C 1个月；-20°C 6个月 |
| Axitinib | -20°C，避光 | 含3 mM HCl蒸馏水或CMC-Na | 现配现用 |
8.2 给药操作规范
腹腔注射 (i.p.)
- 体位：头低臀高倾斜
- 部位：左下腹部，避开中线和膀胱
- 角度：30--45°
- 回抽确认：无血液或尿液
- 体积：≤200 μL/只
口服灌胃 (p.o.)
- 禁食：可选，给药前2--4小时
- 灌胃针：小鼠专用球端灌胃针
- 深度：3--4 cm
- 速度：缓慢均匀
- 体积：≤200 μL/只
8.3 肿瘤测量
- 工具：电子游标卡尺
- 频率：每2--3天
- 伦理终点：肿瘤体积≤2000 mm³或最大直径≤2.0 cm
九、统计分析要点
| 分析类型 | 方法 | 软件 |
|---|---|---|
| 肿瘤体积 | Mean ± SD，Student's t-test | EZR, GraphPad Prism |
| 生存分析 | Kaplan-Meier，Log-rank test | EZR, GraphPad Prism |
| 免疫组化 | Fiji (ImageJ)定量 | ImageJ |
| 流式细胞术 | FlowJo或CytExpert | FlowJo |
十、核心结论与建议
10.1 给药策略建议
| 策略 | 推荐度 | 适用场景 |
|---|---|---|
| ICI 先行 | ★★★★★ | 探索序贯治疗最佳时序 |
| 同时给药 | ★★★★★ | 标准联合用药方案 |
| TKI 先行 | ★★☆☆☆ | 不推荐，效果最差 |
10.2 关键发现
- 联合优于单药：Axitinib + Anti-PD-1/PD-L1联合显著抑制肿瘤并延长生存
- 时序决定疗效：ICI先行或同时给药效果相当；TKI先行显著削弱疗效
- 机制基础：Axitinib上调PD-L1为联合提供靶点，但TKI先行导致免疫微环境恶化
- 免疫 Biomarker：CD8/CD3和CD8/CD11b比值可作为疗效预测指标
- 剂量标准化：RMP1-14推荐200--250 μg/只；Axitinib推荐25 mg/kg
十一、参考文献
- Watanabe H, et al. Assessments of therapeutic effects according to timings for combined therapy with axitinib and immune check point inhibitor in a mouse renal cell carcinoma model. Scientific Reports. 2023;13:11361.
- Agrawal K, et al. Quantification of the anti-murine PD-1 monoclonal antibody RMP1-14 in BALB/c mouse plasma by LC-MS/MS. Anal Bioanal Chem. 2020;412(3):739-752.
- FBPA PET study. Advantages of FBPA PET in evaluating early response of anti-PD-1 immunotherapy in B16F10 melanoma-bearing mice. EJNMMI Res. 2022.
- Shp-1 regulation study. Shp-1 regulates the activity of low-affinity T cells during melanoma tumor growth. J Immunother Cancer. 2024.
- DDR1 CRISPR study. DDR1 is identified as an immunotherapy target for microsatellite stable colon cancer. npj Precision Oncology. 2024.
- Targeted therapy after anti-PD-1. Targeted therapy given after anti-PD-1 leads to prolonged responses in mouse melanoma models. Cancer Immunol Res. 2022.
- PD-1 resistance model. Impact of mouse model tumor implantation site on acquired resistance to anti-PD-1. Cancers. 2022.
- Axitinib + oncolytic virus. Combinatorial effects of VEGFR kinase inhibitor axitinib and oncolytic virotherapy in glioblastoma. Clin Cancer Res. 2018.
- Se-axitinib study. Selenium substituted axitinib reduces side effects and maintains anti-renal tumor activity. J Pharm Pharmacol. 2022.