多样本空间转录组 Harmony 整合与标签转移指南

本文的代码来自Seurat官方网站的空转教程。主要的两个部分是：

Harmony 批次校正：校正多个空间切片之间的技术差异，用校正后的低维空间进行邻居构建、聚类和 UMAP 展示。
单细胞标签转移：以带细胞类型注释的 scRNA-seq 数据为参考，为每个空间 spot 计算各细胞类型的预测分数。

需要注意，Visium spot 通常包含多个细胞。Seurat 标签转移给出的是参考细胞类型与每个 spot 的相似性分数，可以将最高分对应的细胞类型作为该 spot 的预测标签，不等同于细胞比例反卷积。

1. 加载包

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rm(list = ls())
options(future.globals.maxSize = 10 * 1024^3)
set.seed(1234)
library(Seurat)
library(SeuratData)
library(harmony)
library(ggplot2)
library(patchwork)

数据来自10X官方网站，也可以从SeuratData获取。InstallData会安装R包，如果已安装，运行这句代码不会导致重复安装。

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InstallData("stxBrain")
#install.packages("harmony")

2. 数据预处理

先对每个切片单独运行 SCTransform()，以便分别学习各切片的测序深度和技术噪声模型。samples 可以扩展为更多样本。

用merge把多个切片合并到一个Seurat对象中，才能放在一起做降维聚类分群。

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#样本文件夹名称
samples <- c("anterior1", "posterior1")
#实际项目中需要将 LoadData() 替换为Load10X_Spatial()读取数据 。
stlist <- lapply(samples,function(sample_name) {
  st_obj <- LoadData("stxBrain", type = sample_name)
  st_obj$sample_id <- sample_name
  SCTransform(st_obj, assay = "Spatial", verbose = FALSE)
})
names(stlist) <- samples
st <- merge(x = stlist[[1]],y = stlist[-1],
            add.cell.ids = names(stlist))
DefaultAssay(st) <- "SCT"

3. 降维、整合、聚类分群

Harmony用于校正样本间批次效应，还有其他算法，且听下回分解。

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# 每个样本单独计算高变基因，再取交集
features <- Reduce(intersect, lapply(stlist, VariableFeatures))
VariableFeatures(st) <- features

rm(stlist);invisible(gc())

# PCA
st <- RunPCA(st, verbose = FALSE)
#维度数量
dims <- 1:30

st <- RunHarmony(st,
                 group.by.vars = "sample_id",
                 dims.use = dims,
                 verbose = FALSE)

st <- FindNeighbors(st,
                    reduction = "harmony",
                    dims = dims,
                    verbose = FALSE)

st <- FindClusters(st, resolution = 0.5, verbose = FALSE)

st <- RunUMAP(st,
              reduction = "harmony",
              dims = dims,
              verbose = FALSE)

UMAP图展示聚类结果和样本来源，SpatialDimPlot展示每个Cluster的空间分布。

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p1 <- DimPlot(st, group.by = "sample_id") + 
  ggtitle("Samples")+
  coord_fixed()

p2 <- DimPlot(st,group.by = "seurat_clusters",
              label = TRUE,repel = TRUE) +
  ggtitle("Clusters")+
  coord_fixed()
p1 + p2

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SpatialDimPlot(st,
               group.by = "seurat_clusters",
               label = TRUE,label.size = 3,
               ncol = length(Images(st)))

查看感兴趣的基因的空间分布

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DefaultAssay(st) <- "SCT"

SpatialFeaturePlot(st,features = c("Hpca", "Plp1"),
                   ncol = length(Images(st)),
                   alpha = c(0.1, 1))

4. scRNA参考数据

这是小鼠皮层细胞的高质量参考数据，来自 Allen 研究所。下载自 https://www.dropbox.com/s/cuowvm4vrf65pvq/allen_cortex.rds?dl=1

设置 ncells=3000 会将整个数据集归一化，但仅在 3000 个细胞上学习噪声模型。这能显著加快 SCTransform 的速度，且性能无损失。是官网推荐的用法。

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allen_reference <- readRDS("allen_cortex.rds")
dim(allen_reference)

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## [1] 34617 14249

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allen_reference <- SCTransform(allen_reference,
                               ncells = 3000,
                               verbose = FALSE) %>%
  RunPCA(verbose = FALSE) %>%
  RunUMAP(dims = 1:30)

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DimPlot(allen_reference,  group.by  =  "subclass", label = TRUE)+
  NoLegend()+coord_fixed()

简单罗列一下这些细胞类型咯，不研究这个领域的话，只要分清楚这些单词是细胞的名字，不是基因名字就可以啦！


兴奋性神经元	L2/3 IT	第2/3层端脑内投射神经元
兴奋性神经元	L4	第4层颗粒神经元
兴奋性神经元	L5 IT	第5层端脑内投射神经元
兴奋性神经元	L5 PT	第5层锥体束投射神经元
兴奋性神经元	L6 CT	第6层皮层丘脑投射神经元
兴奋性神经元	L6 IT	第6层端脑内投射神经元
兴奋性神经元	L6b	第6b层神经元
兴奋性神经元	NP	近距离投射神经元
抑制性神经元	Lamp5	Lamp5 中间神经元
抑制性神经元	Meis2	Meis2 中间神经元
抑制性神经元	Pvalb	小清蛋白中间神经元
抑制性神经元	Serpinf1	Serpinf1 中间神经元
抑制性神经元	Sncg	Sncg 中间神经元
抑制性神经元	Sst	生长抑素中间神经元
抑制性神经元	Vip	VIP 中间神经元
发育相关神经元	CR	Cajal-Retzius 细胞
非神经元细胞	Astro	星形胶质细胞
非神经元细胞	Endo	血管内皮细胞
非神经元细胞	Macrophage	巨噬细胞/小胶质细胞
非神经元细胞	Oligo	少突胶质细胞
非神经元细胞	Peri	周细胞
非神经元细胞	SMC	平滑肌细胞
非神经元细胞	VLMC	血管及软脑膜细胞

5. 标签转移

寻找锚点，进行标签转移。这里的 st 已经完成了 SCTransform 和 PCA，因此可以直接用于寻找锚点和标签转移。

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anchors <- FindTransferAnchors(reference = allen_reference,
                               query = st,
                               normalization.method = "SCT")

predictions.assay <- TransferData(anchorset = anchors,
                                  refdata = allen_reference$subclass,
                                  prediction.assay = TRUE,
                                  weight.reduction = st[["harmony"]],
                                  dims = dims)
GetAssayData(predictions.assay, layer = "data")[1:4, 1:4]

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##       anterior1_AAACAAGTATCTCCCA-1 anterior1_AAACACCAATAACTGC-1
## Vip                              0                            0
## Lamp5                            0                            0
## Sst                              0                            0
## Sncg                             0                            0
##       anterior1_AAACAGAGCGACTCCT-1 anterior1_AAACAGCTTTCAGAAG-1
## Vip                              0                            0
## Lamp5                            0                            0
## Sst                              0                            0
## Sncg                             0                            0

此时我们得到的predictions.assay是每个spot是每一种细胞的预测分数。把他插入空转Seurat对象作为一个组成部分。

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st[["predictions"]] <- predictions.assay
DefaultAssay(st) <- "predictions"

画图查看其中两种细胞的预测分数。

r 复制代码

features <- c("Astro","L2/3 IT")

SpatialFeaturePlot(st,
                   features = features,
                   pt.size.factor = 1.6,
                   ncol = length(Images(st)),
                   alpha = c(0.1, 1))

以第一个样本为例，寻找(预测分数)有明显空间分布模式的细胞类型。注意，FindSpatiallyVariableFeatures是应该每个样本单独计算的。切换第二个样本时，把 image = samples $1$ 里面的1改为2即可。

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st <- FindSpatiallyVariableFeatures(st,
                                    assay = "predictions",
                                    layer = "data",
                                    features = setdiff(rownames(st), "max"),
                                    image = samples[1],
                                    selection.method = "moransi")

展示 Moran's I 最高的 4 种细胞类型，也就是预测分数空间自相关性最强、空间分布模式最明显的细胞类型。（图上画的是细胞类型预测分数，不是基因表达量，也不是真实细胞数量或者丰度。）。

r 复制代码

top.clusters <- st %>% 
  SpatiallyVariableFeatures(method = "moransi",
                            assay = "predictions") %>% 
  head(4)

top.clusters

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## [1] "L6 CT"      "Meis2"      "L4"         "Macrophage"

r 复制代码

SpatialFeaturePlot(object = st, features = top.clusters, ncol = length(Images(st))) & 
  theme(plot.margin = unit(c(1, 1, 1, 1), "mm"),
        legend.text = element_text(size = 8))

6. 保存结果

最终对象包含 PCA、Harmony embedding、联合聚类以及每个 spot 完整的细胞类型预测分数。

r 复制代码

saveRDS(st, "st.rds")