The chromosome-level genome assembly of Cananga odorata provides insights into its evolution and terpenoid biosynthesis
依兰（Cananga odorata）染色体水平基因组组装揭示其进化与萜类生物合成机制
摘要
依兰（Cananga odorata）为番荔枝科木兰目植物，素有天然香树之称。然而，其系统发育位置以及花香挥发性有机物（VOCs）生物合成的分子机制尚不明确。 本研究整合多种测序平台，组装得到依兰端粒到端粒（T2T）基因组，基因组大小 735.83 Mb，是目前已报道木兰类植物中完整性与组装质量最高的基因组。基于多套数据集与多种分析策略的系统发育结果显示：木兰类的依兰在与单子叶植物分化之后，作为真双子叶植物的姊妹群。
精油与花朵香气的挥发性有机物代谢组分析表明，倍半萜（尤其是 β- 石竹烯）是其主要组分。两次串联复制产生的两个 CoTPS21 同源基因在花发育阶段高表达，被鉴定为催化 β- 石竹烯合成的关键倍半萜合酶基因。此外，CoSPL3 与 CoSPL9 被认定为可激活 CoTPS21 同源基因表达的潜在转录因子。
本研究结果阐释了依兰独特花香物质合成的分子机制，也为解析木兰类的系统发育位置提供了新证据。
引言
依兰（Cananga odorata，俗称 ylang--ylang）是番荔枝科多年生热带常绿乔木，原产印度尼西亚，在东南亚热带地区广泛栽培。作为重要资源植物，依兰被誉为 "花香之王" 与天然香树，具备很高的经济价值与商业化前景。从依兰成熟鲜花中提取的精油是珍贵天然香料，是香水、化妆品行业最重要原料之一。已有研究表明，依兰挥发性有机物以倍半萜、单萜、芳香苯丙烷类、酯类和醚类为主；主要挥发成分为 β- 石竹烯、大根香叶烯 D、(E,E)-α- 法尼烯、对甲酚甲醚、乙酸苄酯、苯甲酸甲酯、乙酸香叶酯。但依兰花部代谢产物，以及花香 VOC 合成通路的调控分子机制仍缺乏深入解析。
依兰属于木兰目；木兰目与白樟目、樟目、胡椒目共同构成木兰类分支。木兰类是植物演化中十分古老的类群，明确其系统发育位置有助于厘清现存被子植物的演化历程。尽管已有大量研究，但木兰类相对于单子叶、真双子叶的系统发育关系长期存在争议。基因组数据是解决该争议的有力工具，近年多个木兰类基因组陆续发表：（1）部分樟科基因组研究支持木兰类为真双子叶的姊妹群；（2）马兜铃科的Aristolochia fimbriata基因组结果支持木兰类是单子叶的姊妹群；（3）望春玉兰、鹅掌楸、鳄梨基因组则提示木兰类同时是单子叶 + 真双子叶二者共同的姊妹群。因此，木兰类的基因组演化是当下热点，但尚未形成共识。番荔枝科是木兰目中第二大科，也是泛热带物种最丰富的类群之一，目前仅有两个草图基因组发表。高质量、有代表性的番荔枝科基因组资源，将助力被子植物系统发育与演化研究。
本研究报道依兰 T2T 完整基因组。通过与其他被子植物的比较基因组、系统发育分析，进一步探讨木兰类的系统发育地位；同时鉴定其花香主要挥发组分与合成通路，解析核心香气物质合成的分子基础。
材料与方法
植物材料
依兰（Cananga odorata (Lamk.) Hook. f. & Thomson.）叶片与花样品采自中国科学院西双版纳热带植物园栽培单株（21°55′11″N，101°15′27″E），采样时间：2021 年 4 月、2022 年 5 月。新鲜叶片用于提取基因组 DNA 开展测序；鲜花用于精油提取与 RNA 提取，供转录组分析。
文库构建与测序
ONT 超长测序：采用 CTAB 法提取依兰基因组 DNA；NanoDrop One 紫外分光光度计检测 DNA 纯度与质量。选取 8--10 μg、片段大于 50 kb 的 DNA 构建文库，于武汉贝纳基因 PromethION 平台完成 ONT 超长测序。 PacBio HiFi 测序：取约 8 μg 基因组 DNA，片段筛选后建库，使用 PacBio Sequel II 平台测序。 二代短读长（NGS）：提取的基因组 DNA 采用 MGIEasy 通用 DNA 建库试剂盒 v1.0 构建文库。 Hi-C 测序：新鲜叶片使用 2% 甲醛交联，DpnII 内切酶酶切，构建 Hi-C 文库。
基因组组装与 Gap 填充
取 65× 覆盖度的 ONT 超长 reads，使用 NextDenovo v2.4.0 进行初步组装（参数：input type=raw; read type=ont; read cut-off=1 k; seed cut-off=99365）。得到的初步参考序列使用 NextPolish，结合 HiFi、Illumina reads 校正（task=55 512 121 212；lgs 参数 =-min_read_len 1k -max_depth 60；lgs_minimap2_options=-x map-ont；sgs_options=-max_depth 100 -bwa）。使用 purge_dups v1.2.5 去除冗余 contig，得到质量较高的 scaffold。
染色体挂载：Hi-C 原始 reads 使用 fastp v0.20.0 默认参数去接头、修剪低质量碱基；clean reads 通过 Bwa-Mem2 v2.2 比对到 contig 序列；juicer v1.6 生成去重后的比对文件；3D-DNA v201008 将 contig 锚定到染色体 scaffold；利用 3D-DNA 可视化模块绘制 Hi-C 互作热图，再通过 Juicebox v1.11.08 人工校正倒置、错位等组装错误，最终得到依兰染色体水平基因组。
基因组注释
使用 RepeatModeler 进行从头重复序列鉴定。采用多款工具识别不同类型重复序列：LTR_FINDER 与 LTRharvest 用于识别 LTR 反转录转座子，MiteHunter 识别 MITE 重复序列，HelitronScanner 识别 Helitron 转座子，SINE-Finder 识别短散在核元件（SINE），TARGeT 识别末端反向重复序列。
以软屏蔽后的基因组为输入，采用从头预测、同源预测、转录组证据预测相结合的策略，通过 BRAKER v2.1.6 完成蛋白编码基因的结构注释。同源参考蛋白序列取自 OrthoDB v10 数据库，包含马兜铃、鹅掌楸、厚朴的蛋白集。使用 Hisat2（v2.2.1）和 minimap2（v2.22-r1101）将 RNA-seq 比对至基因组，ProtHint（v2.5.0）生成蛋白提示信息；最终借助 Augustus（v3.3.3）、GeneMark-ET（v4.38）完成基因预测。
功能注释：采用 BLAST（blastX、blastn，e 值＜1e−10）比对 COG、Pfam、GO、KEGG、Swiss-Prot、NR 数据库；利用 Blast2GO 完成 GO 注释。使用 BUSCO（v4.0）评估基因组组装与注释完整性。此外，将依兰基因组及注释文件提交至 PlantiSMASH 网站，用于生物合成基因簇（BGC）预测。
着丝粒与端粒特征分析
从 RepeatMasker 结果中提取卫星序列与转座子位置；TRF v4.09.1（参数：2 7 7 80 10 50 2000 -h）识别着丝粒区域串联重复序列；vsearch v2.22.1（--clusterout_sort --clusterout_id --fasta_width 0 --id 0.8 --cluster_size）对染色体上同源 CRC 序列聚类；LASTZ（--format=general）比对候选序列，定位 CRC 与着丝粒单拷贝序列，比对覆盖度与相似度均约 80% 判定为高可信结果。使用 pyGenomeTracks v3.8 绘制位置示意图；RectChr v1.35 可视化 MUMmer v4.0.0rc1 鉴定得到的同源染色体之间的共线性区块。
基因组结构比较分析
利用 JCVI 软件鉴定依兰与其他物种间保守的染色体重排事件；共线性模块绘制点阵图、识别共线性区块，锚定基因间最大 gap 设置为 30。随后确定不同物种的重排区域及其连接关系，重建被子植物主要分支的祖先染色体连接模式，并与被子植物共同祖先的预测构型进行比较。
系统发育分析
采用多套数据集与多种分析策略，基于 23 个物种解析木兰类演化关系，包含 5 个真双子叶、5 个单子叶、6 个木兰类、3 个 ANA 基部被子植物、1 个金鱼藻目、1 个金粟兰目、卷柏（外类群参照）以及裸子植物外类群。分别基于单拷贝基因家族（SSCG）、近单拷贝基因家族（MSCG）筛选同源基因集。系统发育树构建：每个基因家族蛋白序列使用 MUSCLE v3.8.31 比对，再通过 Pal2nal v14 将核苷酸序列回贴至蛋白比对结果，得到保留密码子信息的核苷酸比对矩阵。最终，每个基因家族生成 5 种比对矩阵用于构树：蛋白序列、全核苷酸序列、第 1/2 位密码子、第 3 位密码子。分别使用串联法（concatenation） 与**溯祖法（coalescent）**构建进化树。
基因组共线性分析与基因复制事件鉴定
分析细叶香桂、依兰、柳叶蜡梅、无油樟、葡萄的 WGD 对应的 Ks 分布；KaKs_Calculator 计算 Ks 值。每个基因选取最长蛋白序列后，使用 WGDI 计算细叶香桂、柳叶蜡梅、无油樟与依兰之间的同源关系；DupGene_finder 将依兰复制基因对划分为不同复制类型。使用 calculate_4DTv_correction.pl 计算依兰与其他物种同源基因、旁系同源基因的 4DTv 值。
核型演化分析
从公共仓库下载祖先核型 AAK、AEK 数据集；WGDI（-icl，mg=25,25）分析祖先核型与研究物种的共线性；通过 - bi 提取共线性片段，-c、-km 筛选，-ak 可视化物种基因组上祖先核型片段分布。
精油提取与分析
选取 5 个花发育阶段样品：S1（花蕾期）、S2（花瓣展平初期）、S3（初花期）、S4（盛花期）、S5（花末期）。改良水蒸气蒸馏法提取精油：取约 200 g 冷冻鲜花液氮研磨，加入 2000 mL 蒸馏水煮沸蒸馏 4 h；冷凝收集水油混合物，有机相使用 800 μL 正己烷萃取，过滤后装入棕色样品瓶，4℃保存，用于 GC-MS 检测。
花香挥发物检测
采用顶空固相微萃取 - 气相色谱质谱联用（HS-SPME-GC-MS），方法经优化：每个样品取 3--5 朵鲜花置于 50 mL 顶空瓶，封口；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头暴露于样品上方，25±3℃吸附 30 min；萃取头插入 GC 进样口，250℃解吸 1 min 后上机检测。
GC-MS 分析
仪器：安捷伦 7890A 气相色谱 + 5975 质谱检测器，DB-5MS 毛细管柱（30 m）；载气为氦气，恒流 1.2 mL/min。升温程序：初始 80℃，4℃/min 升至 180℃，12℃/min 升至 200℃，保持 2 min 烘烤；进样口 250℃，质谱传输线 290℃；EI 离子源，扫描范围 m/z 50--600。设置空白对照与正己烷溶剂对照，扣背景。借助 ChemStation 匹配 NIST98 质谱库，结合保留指数（RI/Kovats 指数）人工核验物质；与 NIST 已知 RI 数据库比对。相对含量采用归一化峰面积；绝对含量以十五烷作为内标校正峰面积。
转录组测序与分析
转录组样品：新鲜叶片、花朵各 3 份，每份 2 g；每个时间点设置 3 个生物学重复。Eastep 超总 RNA 提取试剂盒提取总 RNA；合格 RNA 使用 VAHTS Universal V6 建库试剂盒构建 RNA-seq 文库，武汉贝纳 NovaSeq 6000 S4 测序平台测序。 HISAT2（--very-sensitive-dta）将 clean reads 比对参考基因组；featureCounts v2.0.3 统计转录本原始 reads 数，R 脚本计算 TPM。TBtools 基于不同花发育阶段基因表达量绘制热图。
候选基因筛选
以 TAIR 数据库拟南芥已知同源基因为参考，BLASTP 识别依兰及另外 22 个物种中萜类、苯丙烷通路基因；TPS 家族利用 TBtools 内置 HMMER，以 PF01397、PF03036 两个结构域搜索蛋白组，E 值阈值 1e−5。 使用在线 MAFFT v7 比对依兰与代表性物种 TPS 蛋白序列；MEGA X 最大似然法构建进化树，bootstrap=1000；iTOL 在线美化进化树。
CoTPS21 同源基因原核表达与体外酶活验证
对 CoTPS21.2（Codo51071）、CoTPS21.3（Codo51075）CDS 序列密码子优化，克隆至 pET28a 载体，转化大肠杆菌 Rosetta (DE3)。单菌落培养至 OD₆₀₀=0.6--0.8，0.1 mM IPTG、28℃诱导 3 h；Ni-NTA 亲和层析纯化重组蛋白。酶活体系：10 ng 重组蛋白 + 10 ng FPP 底物，30℃孵育 2 h；SPME-GC-MS 检测酶促产物。引物见附表。
本氏烟草瞬时表达功能验证
将 CoTPS21.1、CoTPS21.2、CoTPS21.3、AtHMGR1、AtFPPS1 的 CDS 克隆至 PRI101-Flag 过表达载体，转化农杆菌 LBA4404；采用本氏烟草瞬时表达体系验证基因功能。引物见附表。
CoTPS21 启动子顺式元件与转录因子预测
PlantCARE 数据库预测 CoTPS21 启动子顺式作用元件；PlantPAN2.0 数据库预测上游转录因子。
双荧光素酶转录激活实验
双荧光素酶体系验证转录激活活性：分别克隆 3 条 2000 bp 的 CoTPS21 启动子，连入 PRI101-LUC 作为报告载体；转录因子 CDS 连入 PRI101-Flag 作为效应载体。报告载体与效应载体农杆菌等比例混合，注射烟草叶片；成像采集荧光信号，ImageJ 定量荧光强度。引物见附表。
酵母单杂交实验
CoSPL3.1、CoSPL9.1、CoSPL9.2 的 CDS 克隆至 pGADT7-Rec2；CoTPS21.1/2/3 启动子克隆至 pHIS2 载体。AD 载体与 pHIS2 重组质粒共转化 Y187 酵母菌株，使用 Coolaber Y187-pHis2 试剂盒验证蛋白 - DNA 互作。引物见附表。
结果
依兰近乎完整的端粒-到-端粒（T2T）参考基因组
本研究选取种植于西双版纳热带植物园的依兰开展基因组组装。基于 Kmer 分析（K=21）预估基因组大小为 776.04 Mb，杂合度为 0.49%（附图、附表见支持信息）。 本研究整合多个测序平台完成依兰高质量基因组组装：利用 PromethION 平台得到 45.45 Gb 的 ONT 超长读长数据（测序深度 65×）；借助 PacBio Sequel II 平台获得 25.28 Gb 的 HiFi 读长数据（测序深度 37×）（见支持信息附表）。经过组装、纠错抛光以及冗余序列去除后，最终得到大小 735.83 Mb 的基因组，共 19 条 contig，contig N50 为 70.99 Mb，GC 含量 33.16%（图 1，表 1 及支持信息附表）。
进一步使用 HiC-Pro 软件，将 HiC 读长比对至初步组装结果并构建染色体互作图谱；19 条 contig 成功锚定到 8 条假染色体上，可覆盖 95.66% 的 Illumina 短读长以及 99.43% 的 HiC 有效读长（图 1 与支持信息附图，支持信息附表）。最终组装得到 4 条无 Gap 的依兰染色体，其余染色体仅存在 5 个 Gap（见支持信息附表）。
图 1 依兰（ Cananga odorata ）端粒-到-端粒（T2T）基因组组装结果 (a) 基因组信息圈图，包含：染色体假分子信息 (A)、基因密度 (B)、重复序列密度 (C)、Gypsy 转座子密度 (D)、Copia 转座子密度 (E)、GC 含量 (F)、基因组内共线性 (G)。 (b) 端粒与着丝粒检测图谱。红色圆圈代表已组装染色体的端粒；颜色渐变代表基因密度。Chr，染色体；rRNA，核糖体 RNA。
Table 1. Genomic feature of Cananga odorata.
|-----------------------------------------------------|---------|
| Total size of assembled contigs (Mb) | 735.83 |
| Number of contigs (gaps) | 8 (5) |
| GC content (%) | 33.16 |
| Contig N50 (Mb) | 93.52 |
| Number of transcripts | 119 566 |
| Number of non-transposable element transcripts loci | 744 132 |
| Total size of TEs (Mb) | 454.08 |
| Busco (%) | 98.30% |
依据植物端粒特征重复序列（5′端为 CCCTAAA、3′端为 TTTAGGG），本研究在 8 条假染色体的末端共鉴定得到 16 个端粒（见支持信息附表）。预测得到 8 条假染色体的着丝粒区域长度介于 1.00--2.86 Mb 之间（见支持信息附表）。本研究采用多种手段进一步评估组装的完整性与准确性：BUSCO 分析共检测到 1586 个完整保守基因，组装完整度高达 98.3%（见支持信息附图、附表）；约 97.34% 的 RNASeq 读长可以比对回组装基因组（见支持信息附表）。上述结果表明依兰基因组组装近乎完整，这也是木兰类植物中首个端粒到端粒（T2T）基因组。
基因组注释
结合同源预测、从头预测与转录组证据预测，在依兰基因组中共鉴定出 26449 个蛋白编码基因；基因平均长度 4756.32 bp，每个基因平均包含 4.52 个外显子（见支持信息附表）。其基因数量少于望春玉兰（木兰科），多于马兜铃（马兜铃科），与香樟（樟科）相近（见支持信息附表）。通过 COG、Pfam、GO、KEGG、SwissProt、NR 数据库开展功能注释，20863 个（78.88%）预测蛋白编码基因获得功能注释（见支持信息附表）。同时鉴定了依兰基因组中的非编码 RNA，包含 356 个 tRNA、133 个 miRNA 以及 705 个 rRNA（见支持信息附表）。重复序列占基因组总长 61.71%，其中长末端重复反转录转座子（LTR）占 45.72%，包含 29.10% 的 Gypsy 元件、12.58% 的 Copia 元件以及 4.04% 其他未知重复序列（见支持信息附表）。利用 plantiSMASH 基因组挖掘算法对依兰全基因组开展生物合成基因簇（BGC）扫描，共鉴定出 18 个生物合成基因簇，涉及萜类、假定合成通路、糖类、生物碱、木脂素、糖聚酮杂合、糖萜类杂合等生物合成途径（见支持信息附表）。
木兰类在被子植物中的系统发育位置
大量系统发育与基因组测序研究针对被子植物木兰类、单子叶、真双子叶三大类群提出了相互矛盾的演化关系假说。为解析该系统发育争议，本研究首先分析依兰与其他被子植物共有的染色体重排事件，研究类群包含 2 个 ANA 基部被子植物、8 个木兰类、5 个单子叶、6 个真双子叶物种。构建上述基因组的共线性点阵图，重点对应依兰 1、2、4、5 号染色体，包含 A1A2（1 号染色体）、B1B2（2 号染色体）、C1C2（4 号染色体）、D1D2（5 号染色体）共线性模块（见支持信息附图）。结果发现 A1 与 A2 模块在真双子叶中发生融合，但在木兰类和单子叶中没有一致的融合模式；C1C2 模块也观察到相似现象（见支持信息附图）。这说明仅依靠基因组结构比较仍然无法完全厘清木兰类、真双子叶与单子叶三者的系统发育关系。
进一步基于不同数据集开展系统发育分析，使用 OrthoMCL 解析木兰类与 23 个植物物种的演化关系；物种集合包含 5 个真双子叶、5 个单子叶、6 个木兰类、3 个 ANA 类群、1 个金鱼藻目、1 个金粟兰目、卷柏（卷柏科）以及裸子植物外类群银杏（见支持信息附表）。在 23 个代表性物种中共鉴定得到 45 个单拷贝基因家族（SSCG）与 267 个近单拷贝基因家族（MSCG）（见支持信息附表）。分别利用核苷酸序列、氨基酸序列以及 3 类密码子位点序列，采用串联法构建多物种最大似然（ML）系统发育树。基于近单拷贝基因（MSCG）的串联建树结果支持T2 假说：木兰类与真双子叶构成姊妹群，二者共同与单子叶分化（图 2，见支持信息附图）；基于单拷贝基因（SSCG）的串联进化树同样支持 T2 假说（见支持信息附图）。
图 2 依兰与其他被子植物的系统发育关系
(a-c) 基于 267 个近单拷贝基因（MSCG）家族，分别采用串联法（左） 与**溯祖法（右）**构建的系统发育树；输入序列分别为核苷酸序列 (a)、氨基酸序列 (b)、第 3 位密码子序列 (c)。不同颜色代表不同植物类群，从上至下依次为：真双子叶分支（拟南芥、毛果杨、葡萄、水青树、黄杨）；金粟兰目金鱼藻目分支（金鱼藻、金粟兰）；木兰类分支（鹅掌楸、厚朴、依兰、细叶香桂、柳叶蜡梅、马兜铃）；单子叶分支（水稻、高粱、芦笋、浮萍、菖蒲）；ANA 基部被子植物分支（芡实、蓝星睡莲、无油樟）；外类群（银杏）。分支上的数字代表系统发育树的支持度。 (d) 267 个 MSCG 基因树呈现 3 种不同拓扑结构的占比；虚线代表 33% 的平均占比。q1：木兰类作为真双子叶与单子叶二者的共同姊妹群（T1 假说）；q2：木兰类为真双子叶的姊妹群（T2 假说）；q3：木兰类为单子叶的姊妹群（T3 假说）。
进一步采用溯祖法构建单基因树，使用 ASTRAL 软件整合基因树推导物种树。基于 MSCG 数据集的系统发育结果显示，依兰与其余木兰类物种聚为一支，结果强烈支持T2 假说，即木兰类与真双子叶互为姊妹群（q2 占比：核苷酸序列 50.98%、蛋白序列 56.79%、第 3 位密码子 47.06%）（图 2，见支持信息附图）。此外，基于单拷贝基因（SSCG）构建的系统发育树同样显著支持 T2 为主要拓扑结构（见支持信息附图）。综上，串联法与溯祖法得到完全一致且高支持度的拓扑结构（见支持信息附表），表明木兰类更可能与真双子叶互为姊妹群，而非与单子叶、或与单子叶真双子叶共同分支互为姊妹群。
本研究还利用 1393 个单拷贝基因家族构建系统发育树，并结合化石证据开展分化时间校正。结果显示，番荔枝科与木兰科物种的分化时间约为 72.11 百万年前（置信区间 50.7194.02 Ma）；依兰与刺果番荔枝的分化时间约为 27.54 百万年前（置信区间 12.1145.02 Ma）（见支持信息附图）。
比较基因组、全基因组复制与核型演化分析
为解析基因家族演化，使用 OrthoFinder 将依兰基因组与另外 8 个植物基因组进行比较；在依兰基因组中共鉴定得到 751 个扩张基因家族、935 个收缩基因家族（图 3，见支持信息附表）。基因家族在演化过程中发生扩张，产生新功能，有利于提升植物对环境的适应性。GO 富集分析表明，扩张基因家族主要富集于催化活性、次生代谢物生物合成、法尼基焦磷酸代谢、倍半萜合酶活性等通路（图 3，见支持信息附表）。值得注意的是，倍半萜生物合成相关通路显著富集，提示这类基因家族的扩张可能参与依兰花香物质的合成。
图 3 依兰的比较基因组分析与基因组演化
(a) 依兰与其他 8 个物种的基因家族扩张与收缩情况；红色代表扩张基因家族，蓝色代表收缩基因家族，绿色代表无显著变化的基因家族。 (b) 依兰扩张最显著基因家族的 GO 功能富集分析。 (c) 依兰与其他物种同源、旁系同源基因的 Ks 值分布，以及依兰分别与细叶香桂、马兜铃的染色体共线性比对。灰色线条代表基因组间共线性区段，红色线条为示例共线性对。 (d) 基于现存真双子叶祖先核型（AEK）开展的依兰（2n=16）核型演化分析。进化树上数字代表分化时间，单位为百万年前（Ma）。物种缩写：Atri无油樟；Ncol蓝星睡莲；Vvin葡萄；Atha拟南芥；Ayan漾濞槭；Ptri毛果杨；Afim马兜铃；Csal柳叶蜡梅；Moff厚朴；Ache毛叶番荔枝；Codo依兰。
对多个物种旁系同源基因的同义替换率（Ks）分布进一步比较分析显示：依兰不存在物种特异性全基因组复制事件，但经历了木兰类共同的祖先全基因组复制事件（Ks 峰值约 1.78）（图 3）。同时开展四简并位点转换值（4DTv）分析，结果与 Ks 分析保持一致（见支持信息附图）。共线性分析结果表明：依兰马兜铃的共线性深度比为 2∶1，依兰细叶香桂的共线性深度比为 1∶2（图 3、支持信息附图、支持信息附表）。上述结果证实依兰仅发生过一次古老的全基因组复制事件。
本研究还解析依兰染色体演化历史，利用真双子叶祖先核型（AEK）、被子植物祖先核型（AAK），追溯祖先染色体经过重排形成现代依兰基因组的过程。结果显示依兰全部 8 条染色体均发生染色体重排；依兰基因组中分别有 31.85%、24.68% 的基因可比对到 AEK、AAK 祖先基因集（图 3、支持信息附图、支持信息附表）。
依兰花发育过程的花代谢组分析
为明确依兰精油与花香中主要挥发性有机物（VOC）组分，对从绿色花蕾到完全成熟黄花共 5 个花发育阶段的花香物质开展 GCMS 检测（图 4）。在精油中共鉴定出 44 种挥发性物质，在花朵香气中鉴定出 75 种挥发性物质。
图 4 依兰花精油中挥发性有机物（VOC）的代谢分析
(a) 依兰 5 个不同发育阶段花的形态特征。S1：花蕾期；S2：花瓣展平初期；S3：初花期；S4：盛花期；S5：花末期。比例尺，1.5 cm。 (b) S5 时期花朵提取精油的挥发性有机物气相色谱图。箭头指向实验所用内标（正十五烷）；峰旁数字对应支持信息附表中的化合物编号。右上角为 β石竹烯的电子轰击（EI）质谱图。 (c) 依兰花精油中各挥发性有机物的相对含量；实验独立重复 3 次，结果趋势一致。 (d) 依兰 S1S5 时期花精油挥发性有机物的主成分分析（PCA）双标图，图中同时展示变量载荷与样本主成分得分；化合物编号见支持信息附表。
S1S5 五个时期的精油中分别检测到 9、25、30、23、20 种挥发性化合物（图 4、支持信息附图）。不同发育阶段的优势挥发性物质组分存在差异。结合相对含量与绝对含量分析：S1、S2 时期以倍半萜类物质为主，包括 β石竹烯、α石竹烯、β古巴烯；S3 时期依旧以倍半萜为主，同时出现少量苯丙烷类芳香酯，如乙酸香叶酯、苯甲酸苄酯；S4、S5 为花朵逐渐变黄、释放浓郁香气的成熟阶段，同时富集大量倍半萜与芳香酯类物质（支持信息附表）。
基于各时期精油挥发性物质绝对含量开展主成分分析，在 PC1 与 PC2 上均呈高正向得分的物质包含 β石竹烯、α石竹烯、β古巴烯（图 4、支持信息附表）。值得注意，β石竹烯是花成熟阶段精油中含量最高的组分（图 4）。
花朵顶空香气的检测结果同样显示，倍半萜类与苯丙烷类（芳香酯、醚类）为主要挥发物。在 S4、S5 两个成熟阶段，倍半萜占比分别达 64.19%、58.14%，酯类占比分别为 23.45%、32.33%（支持信息附图、附表）。β石竹烯在这两个时期含量显著较高，占比 28.76%、25.13%，与精油检测结果相吻合。上述结果表明，倍半萜与苯丙烷类是依兰花中含量最高的两类代谢物；S4、S5 阶段倍半萜、芳香酯积累量最高，是依兰花最佳采收时期。
萜类与苯丙烷 / 苯类物质的生物合成
为解析依兰花萜类物质合成的分子基础，本研究鉴定出参与两条经典萜类骨架合成通路（MEP 甲基赤藓醇磷酸通路 、MVA 甲羟戊酸通路 ）的共 34 个基因（图 5，支持信息附表）。BGC 生物合成基因簇分析显示，这些基因并未形成生物合成基因簇（支持信息附表）。对 23 个物种的比较基因组分析发现，萜类合成上游通路的绝大多数基因为单拷贝；而负责萜类物质最后一步催化生成萜类产物的萜合酶（TPS）基因家族在依兰基因组中发生扩张。
本研究在依兰基因组鉴定出 56 个 TPS 候选基因；系统发育分析将其划分至 TPSa、TPSb、TPSc、TPSe/f、TPSg 共 6 个亚家族（图 5、支持信息附图与附表）。与另外 5 种木兰类植物对比，依兰的TPSa、TPSb 亚家族发生显著扩张。TPS 家族扩张主要来源于邻近复制（20 个 TPS 基因）与串联复制（22 个 TPS 基因），这两类复制事件可能造就了依兰挥发性萜类物质的丰富度与多样性（图 5，支持信息附表）。
同时，本研究鉴定了依兰基因组中参与苯丙烷合成两条核心通路（莽草酸通路、苯丙氨酸通路）的 75 个关键酶编码基因（支持信息附图、附表）。部分特定苯丙烷合成通路的上游、下游基因，也受到串联复制与邻近复制事件的显著影响，共涉及 39 个基因（支持信息附表）。
图 5 依兰萜类生物合成通路
(a) 依兰甲羟戊酸（MVA）通路与甲基赤藓醇磷酸（MEP）通路的通路示意图，以及通路内酶编码基因的表达模式。关键合酶与中间代谢物分别用红色、黑色字体标注；每个基因旁的 5 个彩色方框代表该基因在 5 个花发育阶段的表达水平。 (b) 依兰与其他代表性物种 TPS（萜合酶）基因家族系统发育树，不同物种的 TPS 序列以不同颜色标记。 (c) RNASeq 检测得到的依兰不同花发育阶段 TPS 基因表达量。上方为 TPS 蛋白系统发育树：红色代表 TPSa 亚家族，绿色代表 TPSb 亚家族，橙色代表 TPSc 亚家族，蓝色代表 TPSe/f 亚家族，紫色代表 TPSg 亚家族；下方图形符号代表各个 TPS 基因的复制起源类型。表达量经过log2(TPM+1)标准化；S 代表依兰花发育阶段；TPM：每百万比对读段中每千碱基转录本的读段数。
转录组进一步分析表明，部分苯丙烷类合成通路基因的表达模式与代谢物释放规律相吻合（见支持信息附表）。负责倍半萜合成的 MVA 通路中，倍半萜合成第一步关键基因在花发育早期高表达；第二步相关基因主要在 S3、S4 时期高表达（图 5）。 在 TPS 基因中，3 个来源于串联复制的TPSa 亚家族基因 TPS21.1 (Codo51068)、 TPS21.2 (Codo51071)、 TPS21.3 (Codo51075) ，是拟南芥TPS21的同源基因；它们在 S2 时期开始特异性激活，并在花成熟阶段维持极高表达水平（图 5）。该表达模式和依兰花主要倍半萜挥发物的释放趋势一致，提示这 3 个 TPSa 基因高表达对倍半萜合成起到重要作用。
倍半萜生物合成的分子基础
为阐明 TPS 基因在依兰倍半萜合成中的功能，克隆这 3 个特异性高表达的CoTPSa 基因开展功能验证。将TPS21同源基因构建至 pET28a 载体，转化大肠杆菌 Rosetta 菌株进行原核表达与体外酶活实验。SPMEGCMS 结果显示：纯化后的 CoTPS21.2、CoTPS21.3 重组蛋白能够以 FPP（法尼基焦磷酸）为底物，特异性催化生成依兰花主要倍半萜产物 β石竹烯（图 6，见支持信息附图）。
本氏烟草瞬时表达实验显示：将CoTPS21.2 / CoTPS21.3 与AtHMGR1 、AtFPPS1 共表达（后两个基因可提升植物异源系统中倍半萜的合成通量），GCMS 可检测到明显的特征产物峰，鉴定为 β石竹烯（见支持信息附图）。 以上结果证明：CoTPS21.2 与 CoTPS21.3 是依兰体内催化 β石竹烯生物合成的关键萜合酶。
图 6 依兰 CoTPS21 同源基因在倍半萜生物合成中的功能鉴定
(a) 以 FPP 为底物的空白对照反应总离子流色谱图（TIC）。 (b) β石竹烯标准品总离子流色谱图。 (c、d) 体外酶活实验中，分别过表达CoTPS21.2 (c)、CoTPS21.3 (d)，以 FPP 为底物得到萜类挥发产物的总离子流色谱图。重组蛋白采用 NiNTA 6FF Sefinose™树脂试剂盒（C600332，BBI）进行纯化；挥发萜类产物采用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用（SPMEGCMS）检测。 (e) 转录激活活性分析：3 种效应子（CoSPL3、CoSPL9.1、CoSPL9.2）对携带CoTPS21 启动子的报告载体的激活活性。 (f) 效应子与对应报告载体共转化后的相对 LUC 荧光活性。数据为平均值 ± 标准差，n=5；*** 代表与对照组相比 P＜0.01（Student's t检验）。m/z：质荷比；红色虚线代表 β石竹烯产物的出峰保留时间。
此外，研究结果表明，TPSe/f 亚家族的Codo13515 与Codo21750 基因在 S4S5 时期显著高表达；在本氏烟草中将二者分别与AtHMGR1 、AtFPPS1共表达，可催化生成 α法尼烯（见支持信息附图）。α法尼烯同样是一类广泛应用于香水工业的倍半萜，在依兰花发育后期两个阶段大量积累。综上，依兰 TPS 基因家族发生扩张之后，花发育中晚期特异性激活的 TPS 基因，在花香主要挥发物 ------ 倍半萜的生物合成过程中发挥关键作用。
萜类合酶编码基因的转录调控，与其启动子区域分布的顺式作用元件密切相关。为筛选能够激活TPS21 转录的转录因子，本研究解析TPS21 编码区上游 2000 bp 启动子区域的顺式元件（见支持信息附图），发现 SBP、MYB 结合元件是这 3 个TPS21基因潜在的上游调控位点。
为进一步验证转录因子能否激活TPS21 启动子，将报告载体（pTPS21:LUC 系列）与效应子载体（35S:TF 系列）共侵染烟草叶片开展转录激活实验。结果显示，将 pTPS21:LUC 分别与 SBP 家族的CoSPL3 (Codo33137)、CoSPL9.1 (Codo13415)、CoSPL9.2 (Codo81486) 共转化，可检测到强烈的 LUC 荧光信号（图 6）。酵母单杂交实验进一步证实 CoSPL3、CoSPL9.1、CoSPL9.2 可以结合TPS21 启动子（见支持信息附图）。而对部分 MYB 结合元件对应的转录因子（如CoMYC2.1 (Codo12352)、CoMYC2.2 (Codo31189)）进行验证，并未检测到激活信号（见支持信息附图）。上述结果表明：CoSPL3 与 CoSPL9 同源蛋白是依兰体内激活 CoTPS21 基因的核心上游转录因子。
讨论
依兰既是全球备受欢迎的香料原料植物，在农业与医药领域同样具备潜在开发价值。依兰属于木兰类番荔枝科，花朵是其产生芳香精油的主要器官。高质量、有代表性的基因组资源，可为依兰及番荔枝科其他物种的花香合成与演化研究提供重要支撑。本研究整合多种测序平台，组装得到依兰高质量 T2T 端粒到端粒基因组；这套近乎完整的基因组组装，无疑将成为依兰乃至整个番荔枝科遗传研究的参考基准。该基因组也有利于利用系统基因组学解析木兰类的系统发育地位，揭示被子植物基因组演化关系。
尽管已有约 20 个木兰类植物基因组，开展了大量系统基因组学分析，但木兰类的系统发育位置依旧存在争议。造成该拓扑冲突的原因可能包括不完全谱系分选（ILS）、古老杂交、物种取样稀疏、植物演化过程中发生的平行演化等。 本研究采用两种互补分析策略，获取单拷贝基因家族（SSCG）、近单拷贝基因家族（MSCG）的核苷酸、氨基酸以及分拆密码子数据集，分别利用串联法与溯祖法重建系统发育树；同时优化物种取样，覆盖木兰类、单子叶、真双子叶、ANA 基部被子植物及其他关键类群。综合所有系统发育分析结果，最大简约地表明：依兰与真双子叶的亲缘关系近于单子叶，即木兰类与真双子叶互为姊妹群，二者的共同祖先再与单子叶发生分化。
依兰凭借独特花香广泛应用于香水、精油产业。在驯化与适应过程中，遗传背景、地理气候、栽培方式均会影响精油与花香中挥发性物质的组分与含量；不同地域的依兰群体挥发物差异明显，部分群体酯类物质占比较高，另一些群体萜类物质可超过总量一半。本研究证实，依兰花馥郁复杂的香气是多种代谢物的混合体系，以倍半萜与芳香酯为主，其中 β石竹烯为核心组分，这些物质共同塑造了依兰特有的花香。
已有研究表明，基因扩张、复制事件造成 TPS 基因的功能分化，是不同物种萜类物质浓度、产物组成产生差异的重要原因。部分 TPS 酶可催化生成多种产物，但大多数 TPS 主要合成 12 种主产物。本研究发现，负责合成主要倍半萜组分的 TPSa 亚家族发生显著复制与扩张；功能实验证实，属于倍半萜合酶的 CoTPS21.2、CoTPS21.3 只特异性产生一种主产物 ------β石竹烯，也就是依兰花最主要的倍半萜。部分 TPS 基因在花香调控上存在功能冗余；本研究中这两个同源、功能相近的CoTPS21基因经过共演化被同时保留，共同参与依兰花代谢物合成。
在矮牵牛、春兰中，已有报道 ERF、NAC、MYB、bHLH 转录因子参与花香挥发物合成基因的调控；而本研究鉴定出 SBP 家族的 CoSPL3、CoSPL9 是调控CoTPS21表达的上游转录因子。
综上，本研究完成依兰高质量 T2T 染色体水平基因组组装，这是木兰类首个端粒到端粒基因组，为解析木兰类系统发育地位提供宝贵基因组资源。本研究解析了依兰花挥发性物质组成，阐明 TPS 基因与花香形成的分子关联，为提升依兰倍半萜产量提供关键遗传依据。这套高质量参考基因组，有助于挖掘精油产量、品质等重要农性状的候选基因，推动依兰商业价值开发。
Data availability
All the raw sequencing data for the Illumina short reads, PacBio HiFi reads and RNA sequencing reads have been deposited in the Science Data Bank (doi: 10.57760/sciencedb.13236). The genome assembly and genome annotation files are available at the Science Data Bank (doi: 10.57760/sciencedb.13195).