精原干细胞（SSCs）是负责精子发生的干细胞，具有自我更新和分化产生功能性精子的能力。SSCs的持续再生对于维持雄性生育力至关重要。然而，SSC池的发育起源尚不清楚。在哺乳动物中，SSCs源自名为 prospermatogonia（ProSG）的前精原细胞，依次发育为增殖型前精原细胞（M-ProSG）、初级过渡型前精原细胞（T1-ProSG）和次级过渡型前精原细胞（T2-ProSG）三种类型。ProSG的迁移和分化过程对于SSC池的建立至关重要，但这一过程的调控机制仍不完全清楚。
2024年04月15日，华中科技大学同济医学院生殖健康研究所袁水桥 教授团队在Cell杂志子刊Cell Reports 上在线发表了题为"hnRNPU is required for spermatogonial stem cell pool establishment in mice "的研究论文，该研究发现核不均一核糖核蛋白hnRNPU是调控SSC池和维持男性生育力的关键因子，其缺失将导致SCOS（唯支持细胞综合征）。单细胞测序揭示hnRNPU在ProSG到SSC转变中有重要调控作用，并发现hnRNPU可调控ProSG中细胞周期相关基因的可变剪接，进而调控ProSG的迁移和分化。爱基百客为本研究提供了单细胞转录组和RIP-seq技术支持，公司创始人/湖北科技学院李泽卿副教授为本文共同一作 。
- 研究目的：
本研究旨在探讨hnRNPU蛋白在ProSG向SSC过渡以及SSC池建立过程中的作用。
- 研究方法：
研究结果
1. hnRNPU的表达贯穿生殖细胞发育，并在精原细胞中高度表达
前期的研究发现hnRNPU在小鼠睾丸支持细胞（Sertoli cells）和雄性生殖细胞中高度表达，细胞定位结果显示在成年小鼠雄性生殖细胞中，hnRNPU在精原细胞、粗线期精母细胞和圆形精子细胞的细胞核中高表达。进一步对Hnrnpu 基因在纯化睾丸细胞中的mRNA表达进行分析确认hnRNPU在精原细胞和粗线期精母细胞中高度表达 （Fig.1A）。检测小鼠睾丸中hnRNPU在胚胎期至成年期的不同时间点[包括E12.5（胚胎第12.5天）、E15.5、E18.5、P3（出生第3天）、P7和P56）]的表达，发现hnRNPU在生殖细胞发育过程中持续表达，并定位于PGCs、ProSG、精原细胞（SG）和精母细胞的核中（Fig.1B）。此外， hnRNPU在胎儿和成人生殖细胞的核中也有表达（Fig.1C）。研究者检测了hnRNPU的表达水平发现hnRNPU在未分化SG和分化SG中都有表达（Fig.1D、1E）。这些数据表明hnRNPU在整个雄性生殖系中都有表达，包括胎儿、新生儿和成年生殖细胞，并定位于ProSG、未分化SG和分化SG的细胞核中（Fig.1F）。
Fig1.hnRNPU在整个雄性生殖系中均有表达
2. 在ProSG中hnRNPU减少会导致小鼠 唯支持 细胞综合征（SCOS）
为了研究hnRNPU在早期雄性生殖细胞发育中的作用，研究者通过将Vasa- Cre小鼠与Hnrnpuflox/flox小鼠杂交，创建了一种条件性敲除小鼠模型，称为Vasa-Cre-cKO或cKO。
通过PCR基因型分析确认了Vasa-Cre-cKO小鼠（Vasa-Cre; Hnrnpuflox/Del ）、杂合子对照小鼠（Hnrnpu+/flox ）和野生型（WT）（Hnrnpu+/+ ）的基因型（Fig.2A）。免疫荧光（IF）分析显示在雄性生殖细胞中成功敲除了hnRNPU（Fig.2B）。与对照组相比，Vasa-Cre-cKO小鼠睾丸中hnRNPU的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（Fig.2C、2D）。生育能力测试显示，Vasa-Cre-cKO的雄性和雌性小鼠都完全不育（Fig.2E）。与不育表型一致，P56的Vasa-Cre-cKO小鼠的睾丸和卵巢在形态上显著小于对照组，DDX4阳性生殖细胞的数量在睾丸和卵巢中也显著减少（Fig.2F）。此外，从P7开始，Vasa-Cre-cKO小鼠的睾丸重量与体重的比例显著低于对照组（Fig.2G）。组织学分析显示，从P5开始生殖细胞逐渐减少，在P10时精小管中很少或没有生殖细胞（Fig.2H）。此外，在成年Vasa-Cre-cKO小鼠的附睾中没有检测到成熟的精子，并且睾丸横截面仅在精小管的基底膜附近剩下一层唯支持细胞（Fig.2I、2J），这与人类不育中的SCOS（唯支持细胞综合征）相似。这些结果表明hnRNPU对于维持小鼠的生殖细胞发育和生育能力至关重要。
Fig2.hnRNPU在精子发生和男性生育能力中的重要作用
3 . hnRNPU对于建立SSC池是必不可少的
通过在P1至P7阶段对睾丸切片进行DDX4（绿色）与PLZF（红色）的免疫荧光，研究发现在P1至P3期间，Vasa-Cre-cKO小鼠与对照小鼠的PLZF阳性细胞（未分化精原细胞）和DDX4阳性细胞（生殖细胞）数量相当，但从P5开始显著减少，表明Vasa-Cre-cKO小鼠睾丸中未分化SG细胞的比例受到影响（Fig.3A-3C）。此外，与对照组相比，Vasa-Cre-cKO小鼠睾丸中c-KIT阳性的分化SG在P7时也显著降低（Fig.3D、3E）。为了探讨精原细胞丢失的原因，研究者使用Ki67（增殖标记物）进行染色，发现在P3和P5时，Vasa-Cre-cKO小鼠中Ki67和PLZF双阳性细胞比例降低（Fig.3F、3G）。通过TUNEL染色进一步分析显示，P5时Vasa-Cre-cKO小鼠中精原细胞的凋亡最为显著。这些结果表明，Vasa-Cre-cKO未分化SG的增殖和凋亡平衡受到干扰。研究者通过生成和分析Hnrnpuflox/flox ;Ddx4 -CreERT2雄性小鼠模型（iKO）表明hnRNPU对于SSCs的长期维持并非必要。这些结果表明hnRNPU对SSC池的建立至关重要，但对SSC的维持并非必要。
Fig3.Vasa-Cre-cKO小鼠SSC池的建立被破坏
4. ProSG迁移需要hnRNPU
由于ProSG需要向基膜迁移并在P3-P5时期建立SSC池，研究者在Vasa-Cre-cKO小鼠中检测了ProSG向精管基膜迁移的效率。在对照小鼠中，大约50%的生殖细胞在P3时迁移到精小管的基底膜，到P5时几乎所有生殖细胞都已完成迁移并紧邻基底膜，而到了P7时，所有的精原细胞与支持细胞定位在基底膜上（Fig.3H、3I）。然而，在Vasa-Cre-cKO小鼠中，与对照组小鼠相比，生殖细胞从P3到P7被困在生精小管管腔中心（Fig.3H、3I），这表明ProSG从中心向精管外周基底膜发生了异常迁移。研究还发现，CDH1（也称为E-cadherin）是一种细胞粘附因子和未分化SG的标志物，其异位表达与ProSG迁移过程受阻有关。在Vasa-Cre-cKO小鼠中，CDH1的mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组（Fig.3J-3L），且CDH1仅在对照小鼠睾丸的P4阶段精小管切片中PLZF阳性生殖细胞中表达，而在Vasa-Cre-cKO小鼠睾丸中则在TRA98阴性的细胞中异位表达（Fig.3M）。这些结果表明，hnRNPU对ProSG的迁移至关重要，ProSG中hnRNPU的缺失导致了CDH1在睾丸中的异常和异位表达 。
5. hnRNPU在ProSG中的减少会影响ProSG的命运
研究发现，Vasa-Cre-cKO小鼠睾丸中ProSG未能成功转变为精原细胞，导致其在睾丸中积累。通过对FOXO1的亚细胞定位进行定量分析，研究人员发现，在Vasa-Cre-cKO小鼠中，精原细胞的比例明显低于对照组，而ProSG的比例明显高于对照组（Fig4A、4B）。进一步的细胞核和细胞质蛋白分离实验显示，Vasa-Cre-cKO小鼠中FOXO1的核质比显著降低，进一步证实了ProSG向精原细胞的转变受阻。通过共染MIWI2（经典的ProSG标记物）和TRA98，研究人员可视化了ProSG向精原细胞转变的缺陷，发现在Vasa-Cre-cKO小鼠中，MIWI2阳性的ProSG在P5时仍存在，而在对照组中已消失（Fig4C、4D）。此外，通过使用最近鉴定的T1-ProSG标记物DNMT3L在P1、P3和P5对Vasa-Cre-cKO小鼠睾丸进行免疫荧光染色，发现在Vasa-Cre-cKO小鼠中，T1-ProSG向T2-ProSG的转变也受到干扰（Fig4E、4F）。这些研究结果表明ProSG中hnRNPU的缺失导致了ProSG的积累和精原细胞的减少，从而阻碍了ProSG到精原细胞的转变。
Fig4. hnRNPU的缺乏破坏了ProSG向精原细胞转变的过程
6 . scRNA-seq定义了Vasa-Cre-cKO小鼠ProSG------SG过渡过程中的缺陷
为了检测Vasa-Cre-cKO小鼠ProSG------SG转化过程中的分子变化，研究者对对照组和Vasa-Cre-cKO小鼠P5时的全睾丸细胞进行了scRNA-seq测序。研究发现在Vasa-Cre-cKO小鼠中hnRNPU在所有类型的睾丸细胞中普遍表达，其在生殖细胞和体细胞簇中的表达模式与蛋白水平一致（Fig1）。与对照组相比，Vasa-Cre-cKO睾丸细胞中的未知细胞有所增加，这表明某些生殖细胞在 hnRNPU 缺失的情况下失去了其独特身份。
为了阐明生殖细胞的细胞异质性，对生殖细胞簇进行了重聚类分析，共鉴定出7个生殖细胞亚群（簇0-6），其中99.4%的细胞分布在簇1-5中，而簇6仅包含0.6%的细胞并与其他簇分离，因此排除了非生殖细胞的簇6（未检测到生殖细胞标记Dazl），继续使用簇0-5进行后续分析（Fig.5A）。总之，Vasa-Cre-cKO小鼠的睾丸细胞主要分布在第0簇中，部分分布在第1、2、4簇中，很少分布在第3簇中，说明生殖细胞亚型在对照组和Vasa-Cre-cKO小鼠睾丸中分布不均匀(Fig.5B)。簇3以分化精原细胞标记物为特征，被分类为分化精原细胞（Diff SG）；簇4被分类为未分化精原细胞（Undiff SG）；簇0和5中的细胞被归类为ProSG，表达前生殖细胞（ProSG）标记物，而未检测到Undiff SG或Diff SG标记物（Fig.5C、5D）。
簇1和2因其转录组特征被暂时命名为"过渡性精原细胞"（Transitional SG），它们共享未分化精原细胞（Undiff SG）和分化精原细胞（Diff SG）的转录组特征（Fig.5E），并在RNA代谢、染色质组织和细胞增殖等GO项中富集，表明它们参与细胞增殖调控。拟时序分析显示，精原细胞沿着ProSG到过渡性SG、未分化SG和分化SG的轨迹发展，簇1和2可能作为这一过程中的中间细胞状态（Fig.5F、5G）。
有趣的是，Vasa-Cre-cKO小鼠的睾丸细胞更倾向于存在于以ProSG为特征的拟时序轨迹早期，并在代表精原细胞的晚期生殖细胞簇中减少（Fig.5H）。大量比例的Vasa-Cre-cKO生殖细胞被鉴定为ProSG（Fig.5I），表明ProSG无法分化，导致Vasa-Cre-cKO睾丸中ProSG的积累。差异表达基因（DEGs）分析显示，与细胞周期调控相关的DEGs在ProSG、过渡性SG和未分化SG簇中排名靠前，提示hnRNPU缺失干扰了生殖过程的转录组网络。
基于UMAP图，Vasa-Cre-cKO生殖细胞按细胞周期阶段分类，结果显示簇1和2（Transitional SG）、簇4（Undiff SG）和簇3（Diff SG）处于活跃的细胞周期阶段，而簇0和5（ProSG）处于G1期，表明阻滞和静止状态（Fig.5J）。统计分析显示，与对照组相比，Vasa-Cre-cKO样本中G1期生殖细胞比例增加（Fig.5K），表明hnRNPU缺失阻碍了有丝分裂激活，使得生殖细胞处于有丝分裂静止状态。这些结果揭示了hnRNPU在ProSG分化和精原细胞增殖中的重要作用，以及其在维持生殖过程中转录组网络稳定中的关键角色 。
Fig5. scRNA-seq定义了Vasa-Cre-cKO小鼠ProSG-SG过渡过程中的缺陷
7. hnRNPU调控细胞周期相关基因的选择性剪接
为探究hnRNPU如何调控精原细胞发育的分子机制，研究者对P4阶段的对照组和Vasa-Cre-cKO小鼠睾丸进行了RNA-seq，发现hnRNPU影响精子发生和细胞分化等过程，可能通过调节基因3'UTR长度来实现。该研究利用rMATS软件分析了RNA-seq数据，发现hnRNPU可能参与了睾丸组织中前体mRNA的选择性剪接(Fig.6A)。在Vasa-Cre-cKO小鼠的睾丸中，与对照组相比，发生了955个差异AS事件，其中大多数是剪接外显子事件。进一步的GO-term分析显示，具有差异AS事件的基因在有丝分裂细胞周期过程中富集(Fig.6B)。选择了与细胞周期相关的三个基因(Vrk1, Slx4和Zfp207)进行可视化分析，发现hnRNPU的缺失导致了这些基因的不同剪接事件(Fig.6C)。此外，还发现了Dazl基因的外显子跳跃事件(图6C)。PCR进一步证实了这些差异AS事件(图6D)。然而这4个基因的RNA表达没有显著差异。这些生物信息学分析表明，hnRNPU可能通过调节细胞周期相关基因的基因网络和精原细胞发育相关基因的选择性剪接来调节精原细胞的发育 。
Fig6. hnRNPU在转录后调控选择性剪接
接下来，为了确认hnRNPU是否能与小鼠生殖细胞的前体mRNA结合，研究者对来自P4睾丸的分离生殖细胞进行 RIP-seq，检测hnRNPU蛋白结合的RNA。GO-term分析显示，hnRNPU结合的转录本在细胞周期和细胞分裂中富集(Fig.7A)。进一步验证了Vrk1、Slx4、Dazl、Ptpn11、Ddx5和Dmrt1等与细胞周期和精原发育相关的mRNA的富集，并通过RIP-QPCR的峰值图显示hnRNPU与这6个基因结合(Fig.7B)。值得注意的是，Vrk1、Slx4和Dazl也发生了选择性剪接(Fig.6C和6D)，这表明hnRNPU可能直接调控Vrk1、Slx4和Dazl的选择性剪接。
Motif分析表明hnRNPU结合位点主要分布在内含子区域（约38.99%），也结合到外显子和3'UTR(Fig.7C)，偏好结合富含GU、UGGG或GUUUU的RNA序列(Fig.7D)。通过比较RNA-seq和RIP-seq数据，发现约20.37%的剪接变化基因转录本被hnRNPU结合，这些转录本富集在细胞迁移、细胞周期和细胞分裂过程中(Fig.7E)。此外，hnRNPU还富集在约29.47%的差异表达转录本上，表明hnRNPU可能通过剪接独立机制调控基因表达。
研究通过分析先前发表的P5小鼠睾丸的免疫沉淀-质谱（IP-MS）数据，进一步阐明了hnRNPU在精原细胞发育中的调节网络，并鉴定了许多潜在的hnRNPU互作蛋白(Fig.7F)。GO和KEGG分析显示这些互作蛋白主要涉及mRNA结合、加工和剪接等途径(Fig.7G)。Co-IP WB验证了DDX5、SRSF3和TRIM28等蛋白与hnRNPU的相互作用。此外，发现hnRNPU与DDX5有共同的互作蛋白(Fig.7H)，这些蛋白参与RNA代谢和mRNA加工等过程(Fig.7I)。结果表明hnRNPU能与RNA结合蛋白互作，并结合前体mRNA来调控精原细胞发育中的选择性剪接(Fig.7J)。
Fig7. hnRNPU结合pre-mRNA并与RNA结合蛋白相互作用
总 结
本研究结果表明，hnRNPU是调控ProSG向SSC转变的重要关键蛋白，可在精原细胞中通过与其他RNA结合蛋白共同作用调控细胞周期相关基因的选择性剪接，进而维持SSC池的建立（Fig8）。这项研究揭示了hnRNPU在精原干细胞发育和SSC池建立中的关键作用，为理解男性生殖细胞发育和治疗男性不育提供了新的见解。
Fig8.hnRNPU调控前精原细胞分化和SSC池建立模式图
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