Unraveling the serial glycosylation in the biosynthesis of steroidal saponins in the medicinal plant Paris polyphylla and their antifungal action
解析药用植物重楼甾体皂苷生物合成中的连续糖基化及其抗真菌作用
摘要
糖--糖糖基转移酶在构建复杂的具有生物活性的皂苷中起着重要作用。在本研究中，我们鉴定了一系列来自广为人知的药用植物滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）的UDP-糖基转移酶，这些酶负责生物合成生物活性甾体皂苷的分支糖链。其中，一个2′-O-鼠李糖转移酶和三个6′-O-葡糖转移酶分别催化了连续的糖基化过程，生成甾体双糖苷和三糖苷。这些UDP-糖基转移酶表现出惊人的底物多样性，生成了一系列24种萜类糖苷，其中包括15种新化合物。基于分子对接模拟和蛋白模型比对识别的关键残基，构建了一个包含44个变体的突变体库，并获得了具有更高催化效率的突变体UGT91AH1Y187A。甾体皂苷对四种广泛传播的人类致病真菌菌株表现出显著的抗真菌活性，其机制归因于依赖麦角固醇对真菌细胞膜的损害，而2′-O-鼠李糖基化与强抗真菌作用密切相关。这些发现阐明了甾体皂苷的生物合成机制，并揭示了它们作为新型抗真菌剂的潜力。
图示摘要
鉴定了六种参与滇重楼甾体皂苷生物合成的UDP-糖基转移酶，揭示了甾体皂苷作为抗真菌剂的潜力。
引言
皂苷是高度多样化的甾体和三萜类糖苷天然产物，具有广泛的生物活性，并在医药、食品和化妆品等多个领域具有重要的商业应用。皂苷的一个重要修饰是糖基化，这几乎完全由属于糖基转移酶家族1（GT1）的尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶（UGTs）催化。由于糖基化是皂苷结构复杂性、多样性、化学稳定性、水溶性和生物活性的重要贡献者，UGTs在皂苷形成中的作用引起了极大兴趣。催化现有糖链延长的酶在UGT家族中形成了一个独特的群体，往往赋予皂苷独特的特性，如更好的生物活性和口感，以人参皂苷和甜菊糖苷为例。然而，识别催化新糖基单位添加到已结合糖残基上的糖-糖糖基转移酶仍然是一个挑战。UGTs是一个高度分化的多基因家族，而接受附加糖基的皂苷中间体在含皂苷生物体中仅以微量形式存在。从系统发育上看，大多数已鉴定的植物糖-糖糖基转移酶属于UGT73、UGT74、UGT76或UGT94亚家族。例如，UGT74G1和UGT76G1已被鉴定为催化甜菊糖苷（双萜类糖苷）糖链延长的酶，UGTPg29、Pn3-31和Pn3-32则催化人参皂苷（三萜类糖苷）的糖链延长，而GAME17、GAME18和GAME2则参与马铃薯中甾体糖生物碱的糖基化。然而，考虑到植物中甾体皂苷的种类繁多，催化糖-糖键合形成甾体多糖苷的糖基转移酶研究仍十分不足。
重楼属（Paris）隶属于藜芦科（Melanthiaceae），包括世界各地著名的传统药用植物。特别是滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）和中华重楼（Paris polyphylla var. chinensis）是自1977年以来被收录于《中国药典》的中药材"重楼"的原材料。重楼在超过100种中成药和中药处方中作为重要成分使用，如著名的"云南白药"系列和用于止血的"宫血宁"胶囊。由于市场需求增加、过度开采以及栖息地破坏，过去几十年间，野生重楼属植物变得稀有甚至濒危。甾体皂苷（以下简称PSs）是重楼皂苷的主要活性成分，迄今为止，从不同种类的重楼中已分离和鉴定出200多种天然存在的甾体皂苷（主要为螺甾醇型）。其中，PSI、PSII和PSVII被认为是评估重楼及其制剂质量的重要标志性化合物。此外，PSs表现出广泛的药理活性，包括抗肿瘤、抗血管生成、止血、免疫刺激、抗真菌、驱虫和抗病毒等特性，因而在药物发现中备受关注。然而，由于野生资源减少、栽培植物生长缓慢（7-8年），以及从天然混合物中分离纯化的过程复杂且成本高，PSs的可用性仍然是研究和药用中的主要限制因素。甾体皂苷的化学合成也面临多重挑战，包括甾体苷元的结构复杂性以及糖基化反应的区域和立体选择性差。相比之下，使用合成生物学和酶转化进行生物技术生产，已成功用于大量生产青蒿酸、人参皂苷等天然产物，可以用环保的方式来生产特定PSs。
尽管重楼属植物具有巨大的基因组（约80Gb），且尚未完成全基因组测序，也没有建立这些植物的基因操作方法，但PSs的生物合成研究已经开始进行。对于PSs的两个主要甾体苷元，薯蓣皂苷元和东莨菪皂苷元，参与其从胆固醇形成的细胞色素P450酶最近已从滇重楼、胡芦巴（Trigonella foenum-graecum）和生姜薯蓣（Dioscorea zingiberensis）中鉴定出。然而，对这类化合物结构和生物活性变化的主要贡献步骤------后续糖基化步骤的理解仍然存在巨大空白。迄今为止，从重楼属植物中已鉴定出约90种衍生自薯蓣皂苷元和东莨菪皂苷元的螺甾醇型皂苷，包括单糖苷、双糖苷、三糖苷和四糖苷。它们的糖链通常由d-葡萄糖、l-鼠李糖、l-阿拉伯糖、d-木糖、d-芹菜糖、d-半乳糖或l-岩藻糖组成。研究表明，糖基的数量、种类及其连接方式对PSs的化学性质、药理活性和生物吸收能力具有关键影响。因此，UGTs在PSs的构建中引起了相当的兴趣，但负责糖-糖糖基化的专用UGTs仍然未被明确，这是PS生物合成途径中最后未被描述的步骤。
在本研究中，我们报告了从滇重楼中功能鉴定的一系列6种UDP-糖基转移酶，其中包括4种新型糖-糖葡糖基转移酶，它们能够催化连续的糖基化过程，生成甾体双糖苷和三糖苷。此外，还描述了PSs对四种广泛传播的人类致病真菌------红色毛癣菌、绵状表皮癣菌、石膏样小孢子菌和耐氟康唑白色念珠菌------的抗真菌作用。
材料与方法
2.1 植物材料和转录组分析
从野外采集了滇重楼（采集地：云南省禄劝县，北纬24°58′36.78″，东经102°28′35.27″，海拔1879米，栖息地为以丽叶栎为主的常绿阔叶林）。该植物标本（采集编号：JiYH2013104）由季云恒教授鉴定，并存放于中国科学院昆明植物研究所。植物被重新栽种并在温室中生长。使用Illumina测序仪以Solexa RNA（双端）模式对滇重楼全株的总RNA进行RNA-seq。关于转录组分析的更多详细信息见补充信息中的材料与方法。
2.2 分子克隆与异源表达
使用特异性引物（见补充信息表S1），通过PCR从由EasyScript® First-Strand cDNA合成试剂盒（全式金生物技术）合成的cDNA第一链中扩增UGT基因。随后，这些基因通过ClonExpress® Ultra一步克隆试剂盒（Vazyme Biotech）亚克隆至pCold-TF载体，并转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株。经菌落PCR和DNA测序确认后，阳性转化子在16℃下用0.3 mmol/L异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达目标蛋白。按照制造商说明，使用Ni-NTA琼脂糖柱（Qiagen）纯化重组蛋白，洗脱缓冲液（pH 8.0）含有0.5 mol/L NaCl、250 mmol/L咪唑和5 mmol/L DTT，用于纯化目标蛋白。通过SDS-PAGE分析粗裂解液和纯化的蛋白。纯化的蛋白被浓缩至30 kDa的超滤离心管（Millipore）中，然后在18℃下用HRV 3C蛋白酶（Takara）处理2小时，以去除TF标签。融合或去除TF标签的重组蛋白通过SDS-PAGE分析，蛋白浓度使用BCA蛋白定量试剂盒（NCM Biotech）测定。更多详细信息见补充信息中的材料与方法。
2.3 体外酶活性测定
带有TF标签融合或去除的重组UGT蛋白用于体外测定酶活性，而含有空载体pCold-TF的裂解液作为阴性对照。反应在200 μL的最终体积中进行，包含50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、50 μmol/L糖受体、100 μmol/L UDP-葡萄糖或UDP-鼠李糖以及100 μg重组蛋白。反应混合物在37℃孵育6小时。使用离心浓缩仪（Eppendorf）在减压下浓缩反应产物，将其溶解在100 μL甲醇中，并在12000 rpm离心10分钟，以进行后续产物分析。
上清液（20 μL）通过HPLC配备二极管阵列检测器（HPLC‒DAD，Agilent 1260系统）分析，使用Agilent ZORBAX SB-C18分析柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm），流速为1 mL/min，柱温为35℃。PpUGT 1和2的酶促产物使用线性梯度的44%到86%乙腈与水（0--18分钟）分离，随后是18.01到22分钟的86%到100%乙腈与水的梯度，并用100%乙腈洗脱12分钟，在195 nm波长下检测。PpUGT 3--6的酶促产物使用30分钟内5%到100%乙腈与水的线性梯度分离。
同时，所有PpUGT的酶促产物使用UPLC‒MS/MS分析，在Agilent 1290 Infinity LC与6530 Q-TOF MS耦合的电喷雾电离装置上以正离子模式进行。UPLC条件和注射体积与HPLC‒DAD分析一致，流动相为0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）。Q-TOF源参数设置如下：扫描范围200--1400 Da；干气流速8.0 L/min；气体温度300℃；雾化器压力35 psig；VCap为3.5 kV。使用Qualitative Analysis B.06.00软件进行数据分析。
2.4 产物纯化与结构鉴定
为了分离PpUGT的糖基化产物，使用500 mL大肠杆菌培养物制备的40 mL粗酶进行酶反应，并使用超过3 mg的每种糖受体底物（详细信息见补充信息中的材料与方法）。反应混合物在37℃孵育过夜，并使用旋转蒸发器浓缩。残留物溶解在甲醇中，并通过Sephadex LH-20柱层析（氯仿/甲醇，1:1）和半制备HPLC（ZORBAX SB-C18柱，5 μm，9.4 mm × 250 mm）纯化，使用不同的乙腈/H2O洗脱系统（分别为55%、40%、42%、65%、80%、65%、40%、55%、44%）获得化合物5（tR = 15.9分钟，2.3 mg）、14（tR = 8.9分钟，4.5 mg）、21（tR = 10.3分钟，1.0 mg）、41（tR = 16.0分钟，0.8 mg）、43（tR = 11.4分钟，1.3 mg）、44（tR = 15.4分钟，4.0 mg）、45（tR = 8.9分钟，1.0 mg）、46（tR = 19.5分钟，0.8 mg）和53（tR = 11.5分钟，3.0 mg）。化合物23a（tR = 9.5分钟，2.5 mg）和26（tR = 8.6分钟，3.5 mg）通过22%到64%的线性梯度水-乙腈（0--14分钟）获得。NMR谱图在Bruker AV-600或AV-800光谱仪上记录，TMS为内标。其他产品，包括化合物3、13、gracillin、PSI、PSII、PSIII、PSVI和PSVII，通过与从Chengdu HerbSubstance Co., Ltd.或Chengdu Must Bio-technology Co. Ltd购买的标准品对比鉴定。
2.5 转化率分析
酶反应系统与上述描述相同。使用水（A）和乙腈（B）作为流动相，通过HPLC‒DAD分析酶促产物。对于8‒10、15--18和39--40的产物，使用梯度10%--95%的B在A中的流动相（0--28分钟），然后以95%的B等度（28.01--33分钟）洗脱。对于27‒32和38的产物，使用梯度34%--100%的B（0--22分钟），然后以100%的B等度（22.01--37分钟）洗脱。对于由PpUGT 4--6突变体催化的6和15的产物，使用梯度22%--73%的B（0--17分钟），然后以95%的B等度（17.01--22分钟）洗脱。注射体积为30 μL。转化率百分比（%）根据HPLC‒DAD的酶促产物和底物峰面积计算，参考文献中的方法。
2.6 动力学研究
为了确定PpUGTs的动力学参数，体外酶活性测定在最终体积为100 μL的反应中进行，包含50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、UDP-糖供体（2 mmol/L UDP-葡萄糖或1.5 mmol/L UDP-鼠李糖）、不同浓度的糖受体（PpUGT 1-2使用薯蓣皂苷浓度为2.5、5、10、20、40、60、80、100、200、400 μmol/L，PpUGT3使用薯蓣皂苷元三糖苷，PpUGT 4-6使用PSVI）以及纯化的重组蛋白（PpUGT1 100 μg，PpUGT2 100 μg，PpUGT3 50 μg，PpUGT4 50 μg，PpUGT5 300 μg，或PpUGT6 50 μg）。混合物分别在37 °C下孵育30分钟（PpUGT 1、2、3和5）或20分钟（PpUGT 4和6）。反应通过加入100 μL甲醇终止并浓缩，随后将产物溶解在100 μL甲醇中，离心后取上清液。PpUGT 4和5的反应产物上清液（40 μL）使用HPLC‒DAD分析，而PpUGT 1、3和6的反应产物上清液（10 μL）或PpUGT2的反应产物上清液（20 μL）使用UPLC‒MS/MS分析。UPLC‒MS/MS分析的流动相为0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）。对于PpUGT 1-3的产物，使用50%到95%的B线性梯度（0到15分钟），PpUGT 6的流动条件与PpUGT 4和5相同。所有实验均进行三次重复。使用HPLC‒DAD（用于PSVI）或UPLC‒MS/MS（用于薯蓣皂苷元三糖苷和PSV）生成薯蓣皂苷元三糖苷、PSV和PSVI的六种梯度标准样品（分别为3.125、6.25、12.5、25、50和100 μmol/L，PSVI为5、10、20、40和80 μmol/L）的校准曲线，线性曲线由峰面积与浓度绘制而得。通过线性研究得到的方程和相关系数分别为：薯蓣皂苷元三糖苷y = 2037.6χ + 27222.0 (R² = 0.997)，PSVy = 2583.4χ + 4436.9 (R² = 0.996)，PSVIy = 658.9χ + 10.5 (R² = 0.999)。根据峰面积和校准曲线计算各酶反应的产物产量。KM值通过将初始反应速率拟合到非线性米氏方程使用GraphPad Prism 8.0计算得出。
2.7 基因表达与植物中甾体皂苷含量的分析
分别从在温室中生长的成熟滇重楼的叶、茎、根茎和须根中收集并用液氮磨成粉末。使用SteadyPure Plant RNA提取试剂盒（Accurate Biology）提取总RNA。根据产品说明，在Applied Biosystems 7500仪器（Life Technologies）上使用UltraSYBR混合试剂（带ROX）（TRANSgen）进行实时qPCR。肌动蛋白基因作为内参照基因，使用ΔΔCT方法计算相对表达水平。实时qPCR实验进行了三次独立的生物学重复，每次生物学重复进行三次技术重复。同时，使用甲醇提取叶、茎、根茎和须根的粉末，使用UPLC‒MS/MS分析。通过线性研究获得的方程和相关系数分别为：化合物6 y = 441.5χ ‒ 20.1 (R² = 0.9936)，化合物14 y = 2894.8χ ‒ 999.4 (R² = 0.9986)，PSI y = 254.9χ + 22.0 (R² = 0.9999)，PSII y = 422.8χ ‒ 19.7 (R² = 1)，PSVII y = 477.3χ + 323.8 (R² = 0.9978)。根据峰面积和校准曲线计算甾体皂苷的含量。有关化合物定量的更多详细信息见补充信息中的材料与方法。
2.8 分子对接、定点突变与酶活性测定
使用Uni-fold服务器构建PpUGT 1和3--6的3D蛋白模型（Hermite）。使用PyMOL进行结构比对。通过AutoDockTools-1.5.6软件将苷元和糖供体对接到PpUGT模型的结合位点中。使用Discovery Studio 4.0预测受体-配体相互作用。所有图中的结构均由PyMOL生成。使用重叠延伸PCR构建突变体，然后将其亚克隆到pCold-TF载体中。引物列表见补充信息表S1。这些突变体的重组蛋白分别进行纯化和定量，并按照上述方法进行体外酶活性测定。
2.9 抗真菌活性测定
T. rubrum ATCC4438、E. floccosum（CBS 566.94）和M. gypseum（CBS 118893）购自中国医学科学院皮肤病医院，昆明医科大学第一附属医院皮肤科提供了耐氟康唑的C. albicans菌株。将199 μL微生物悬浮液和1 μL不同浓度的测试化合物（溶于DMSO）加入96孔板中，分别在28°C下孵育5天（皮肤癣菌）或在37°C下孵育24小时（耐氟康唑C. albicans）。使用微孔板读数器（SpectraMax plus 384，MD，美国）记录625 nm的吸光值。盐酸特比萘芬或两性霉素B作为阳性对照，DMSO和微生物悬浮液分别作为阴性和空白对照。每个实验进行了三次重复。使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。有关抗真菌活性的详细信息见补充信息中的材料与方法。
结果
3.1 候选糖-糖糖基转移酶的克隆与异源表达
为了发现在PSs生物合成中负责糖链延长的UGTs，分别对一年生至五年生的滇重楼植物进行转录组测序，使用Solexa双端测序技术（补充信息表S3和S4），因为PSs的含量被报道与植物年龄密切相关。结果发现转录组库中有793个预测编码糖基转移酶的单基因，其中104个属于糖基转移酶家族1（GT1）。在至少一个测序样本中，41个推定的UGT单基因的表达水平被认为是显著的，且其每百万个映射读取的每千碱基外显子模型读取数（RPKM）大于5（补充信息图S1，表S5）。由于标志性化合物PSVII主要在叶片中积累（图S1），并且实验中叶片的RNA质量优于根茎，因此使用滇重楼叶片的cDNA克隆目标基因。最终成功扩增了12个全长cDNA序列（PpUGT 1-12）。计算并绘制了已鉴定的植物糖-糖糖基转移酶和PpUGT 1-12的邻接法系统发育树，包括两个甾醇葡萄糖基转移酶PpUGT73CR1和Dz3GT1，分别从滇重楼和生姜薯蓣中鉴定出（补充信息图S2）。从系统发育树上可以看出，PpUGT 3-8和11在进化上与糖-糖鼠李糖或葡糖基转移酶相关，而PpUGT 1、2、9、10和12与属于UGT80和UGT73亚家族的甾体3-O葡糖基转移酶有较近的系统发育关系。发现PpUGT 1和2与Dz3GT1关系最为密切，而PpUGT3与从薯蓣属植物D. zingiberensis中鉴定出的2′-O-鼠李糖基转移酶DzGT1接近。两组的代表被选为候选基因用于进一步研究，并亚克隆至pCold-TF载体中，并在大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株中异源表达。SDS-PAGE分析显示，在低温下用IPTG诱导后，预期分子量的重组蛋白存在于可溶性部分中（补充信息图S3）。随后，这些重组蛋白通过Ni-NTA琼脂糖柱纯化，用于进一步功能表征。
3.2 两种甾醇3-O-β-葡糖基转移酶和一种甾体糖苷2′-O-鼠李糖基转移酶的功能表征
大多数PSs，包括标志性化合物PSI、PSII和PSVII，在甾体核的3位上有一个α-l-鼠李糖基-(1→2)-葡糖苷残基。为了开始构建这一残基，我们首先表征了两个甾醇3-O-β-葡糖基转移酶PpUGT 1和2（分别命名为UGT80A40和UGT80A41），它们都能将甾体苷元薯蓣皂苷元（1）和东莨菪皂苷元（2）分别转化为薯蓣皂苷元3-O-葡糖苷（3，三苷元）和东莨菪皂苷元3-O-葡糖苷（4）（图1A，补充信息图S4和S5）。然而，UGT80A40和UGT80A41均不能催化后续的糖基化反应。UGT80A40和UGT80A41与最近从滇重楼中鉴定出的甾醇3-O-β-葡糖基转移酶UGT80A33和UGT80A34的同源性分别为99%。然而，UGT80A40的N端比甾醇3-O-β-葡糖基转移酶UGT80A33短34个氨基酸。UGT80A40和UGT80A41对薯蓣皂苷元的表观KM值分别为6.1 ± 0.7和5.9 ± 0.5 μmol/L（补充信息图S6，表S6），比UGT80A33和UGT80A34的KM值更低，表明它们可能是滇重楼不同群体中的天然变异。
图1. 异源表达后滇重楼UDP-糖基转移酶的功能表征。 (A) 六种已鉴定的UDP-糖基转移酶在滇重楼皂苷生物合成中的连续糖基化反应。UGT80A40和UGT80A41对薯蓣皂苷元（1）和东莨菪皂苷元（2）进行葡糖基化，生成的单糖苷3和4分别通过UGT73CE1转化为鼠李糖化的双糖苷5和6。这些双糖苷随后通过UGT91AH 1--3催化的第二次葡糖基化反应转化为三糖苷13和14。 (B) HPLC‒DAD分析显示UGT73CE1催化将3和4分别转化为5和6。 (C) HPLC‒DAD分析显示UGT91AH 1--3催化将5和6分别转化为13和14。产品峰在灰色框中突出显示。对照实验中，表达了空载体。
为了鉴定将鼠李糖转移至薯蓣皂苷元和东莨菪皂苷元葡糖苷的鼠李糖转移酶，使用UDP-鼠李糖作为糖供体进行了体外酶促反应。结果表明，PpUGT3（命名为UGT73CE1）可以将化合物3和4分别转化为PSV（5）和PSVI（6），其结构通过与市售标准品的比较得到鉴定（图1A-B和图S5）。此外，从制备规模的酶促反应中纯化出产物5，并通过1D和2D NMR光谱鉴定，显示出H-1′′（δH 5.21）和C-2′（δC 79.0）之间的HMBC相关性（补充信息图S7--S10）。因此，UGT73CE1被表征为一种甾体糖苷2′-O-鼠李糖基转移酶，能够将鼠李糖基转移到薯蓣皂苷元和东莨菪皂苷元3-O-葡糖苷的C-2′位。UGT73CE1含有1455 bp的开放阅读框，编码一个484个氨基酸的蛋白。UGT73CE1对三苷元的表观KM值为7.1 ± 2.1 μmol/L（图S6，表S6）。
为了研究UGT73CE1的糖受体选择性，从化合物库中选择了16种天然产物（化合物7--11和S1--S11），包括甾体、三萜、双萜、单萜和黄酮类单葡糖苷，与该酶及UDP-鼠李糖共同孵育（图2A和补充信息图S11）。然而，只有豆甾醇葡糖苷（7），即UGT80A40和41催化的β-谷甾醇的葡糖基化产物，生成了产物。该产物通过其[M+H]+ 和[M+Na]+离子（m/z 723.4和745.1）鉴定为鼠李糖化豆甾醇（12）。UPLC‒MS/MS分析显示，其他底物未被UGT73CE1糖基化。此外，UGT73CE1无法接受UDP-葡萄糖或UDP-阿拉伯糖作为糖供体，当使用化合物3作为糖受体时也是如此（补充信息图S12）。这些结果表明，UGT73CE1可以特异性地在甾体3-O-葡糖苷的C-2′位延长一个鼠李糖基。
图2. 滇重楼UDP-糖基转移酶对糖受体的底物特异性。 (A) UGT73CE1和UGT91AH 1--3的糖受体及其糖基化产物的结构。UGT73CE1的底物和产物用黑色表示，UGT91AH 1--3的底物和产物用红色表示。 (B) UGT80A40和41的糖受体及其糖基化产物的结构。UGT80A40和41的底物和产物用蓝色表示，仅UGT80A40的用紫色表示。红色星号表示先前未描述的化合物。 (C) UGT91AH 1--3催化化合物5--6、8--10和15--18的转化率（以百分比表示）。 (D) UGT80A40和41催化底物27--32和38--40的转化率（以百分比表示）。
3.3 三种参与甾体三糖苷生物合成的甾体糖苷6′-O-葡糖基转移酶的功能表征
为了筛选负责后续糖基化步骤的糖基转移酶，使用PSV（5）和PSVI（6）作为底物，这两者被认为是主要PSs（包括I、II、III、VII和H）的潜在生物合成前体。当5或6与PpUGT 4--6和UDP-葡糖共同孵育时，反应混合物中发现的产物（分别为13和14）具有额外的葡萄糖残基（图1C和图S5）。通过与标准品的HPLC‒DAD和UPLC‒MS/MS比较，化合物13被鉴定为薯蓣皂苷元-3-O-鼠李糖基-(1→2)-[葡糖基-(1→6)]-葡糖苷。产物14从酶促反应中纯化，通过1D和2D NMR光谱表征其结构为trikamsesuquiside B（东莨菪皂苷元-3-O-鼠李糖基-(1→2)-[葡糖基-(1→6)]-葡糖苷），显示出H-1‴（δH 4.39）和C-6′（δC 69.6）之间的HMBC相关性（补充信息图S13--S21）。正如预期的那样，PpUGT 4--6无法催化甾体苷元薯蓣皂苷元（1）和东莨菪皂苷元（2）的葡糖基化，表明它们是糖-糖糖基转移酶，作用为甾体糖苷6′-O-葡糖基转移酶，与糖-甾醇糖基转移酶UGT80A40和41不同。PpUGT 4--6包含分别编码465、467和466个氨基酸的1398、1404和1401个核苷酸的ORF，其蛋白质序列具有72%-90%的同源性。根据UGT命名委员会，PpUGT 4--6被命名为UGT91AH 1--3，它们是首次功能性表征的UGT91亚家族的葡糖苷6′-O-葡糖基转移酶。UGT91AH 1--3在酶特性方面存在差异。UGT91AH 1--3对6的表观KM值分别为6.4 ± 1.3、13.7 ± 0.7和12.4 ± 0.2 mmol/L（图S6，表S6）。
分析了这些已鉴定UGT基因在滇重楼不同组织中的表达谱，并同时通过UPLC‒MS/MS量化了酶促产物以及标志性化合物PSI、PSII和PSVII的含量（图S1）。UGT91AH 1和3以及UGT73CE1和UGT80A40的表达主要在根茎中。而UGT91AH2在须根中表达最高，其次是根茎，而UGT80A41主要在叶片中表达。三糖苷产物14主要在须根和根茎中积累，这与UGT91AH 1--3、UGT73CE1和UGT80A40的转录谱一致，表明这些基因可能参与了化合物14的生物合成。双糖苷产物6仅在叶片中检测到。此外，PSI和PSII主要在根茎中积累，而PSVII在叶片中含量最高，其次是须根和根茎。
3.4 探索甾体三糖苷组装中的糖基化步骤顺序
考虑到许多PSs是三糖或四糖苷，含有共同的α-l-鼠李糖基-(1→2)-葡糖苷基团，我们通过比较PpUGTs的底物偏好性来研究糖基化顺序。测试了以4′-阿拉伯糖取代2′-鼠李糖作为其第二个糖基的甾体皂苷作为UGT73CE1的底物。结果表明，UGT73CE1无法接受薯蓣皂苷元-3-O-阿拉伯糖基-(1→4)-葡糖苷（S1）或东莨菪皂苷元-3-O-阿拉伯糖基-(1→4)-葡糖苷（S2）（补充信息图S22），表明2′-鼠李糖基化无法跟随4′-阿拉伯糖基化。此外，测试了缺少2′-鼠李糖的甾体单糖苷3作为UGT91AH 1--3的底物。结果显示，UGT91AH 1--3可以糖基化化合物3，但产物------薯蓣皂苷元-3-O-葡糖基-(1→6)-葡糖苷（先前从滇重楼中分离得到）------仅在UPLC‒MS/MS中以痕量检测到。因此，UGT91AH 1--3更倾向于以甾体双糖苷5和6作为底物，而不是单糖苷3（补充信息表S7）。这一结果暗示6′-葡糖基化可能发生在2′-鼠李糖基化之后。这进一步支持了2′-鼠李糖基化可能作为PSs形成中的第二个糖基化步骤的作用。然而，当UGT91AH 1--3与甾体二/三/四糖苷S1、S2及PSI、PSII和PSIII共同孵育时，未检测到任何酶促产物。
3.5 探索已鉴定糖基转移酶的底物特异性
共孵育了18种结构多样的天然产物与UDP-葡萄糖，以确定UGT91AH 1--3的底物特异性（图2A和补充信息图S11），包括甾体糖苷（7）、三萜糖苷（11、18）、双萜糖苷（8--10、15--17、S3）、环烯醚萜糖苷（S4和S5）、黄酮糖苷（S6--S8）和酚类糖苷（S9--S11）。UGT91AH 1--3均未能接受甾体单糖苷7。然而，当UGT91AH 1--3与达玛烷和葫芦烷三萜糖苷11和18以及喇叭烯和重排松香烯双萜糖苷8--10和15--17分别孵育时，通过UPLC‒MS/MS检测到m/z值比底物高出162的特异性离子峰（补充信息图S23）。因此，产物19--26被暂定为相应的6′-O-葡糖苷同系物，其中包括一种稀有的人参皂苷22。
图3. UGT91AH 1--3对糖供体的底物特异性分析。 (A--B) 使用化合物6和UDP-阿拉伯糖（UDP-Ara）或UDP-鼠李糖（UDP-Rha）作为底物，通过UPLC‒MS/MS分析含有重组UGT91AH 1--3蛋白的反应混合物。对照组为含空载体的反应混合物分析。 (C--D) (A)和(B)中正离子ESI-MS显示的特定产物峰1和2。m/z 893和m/z 907的离子峰分别代表阿拉伯糖和鼠李糖添加到化合物6（m/z 761）上。
为比较，还研究了两种甾醇3-O-β-葡糖基转移酶UGT80A40和UGT80A41的底物特异性。UGT80A40和41均可接受一系列甾体（27--32用于UGT80A40和41，而33--35仅用于UGT80A40）（图2B）。这些化合物均未含有1和2的原生甾醇底物的C-17侧链5,6-螺缩酮基团，因此UGT80A40和41的底物选择性似乎与此基团无关。有趣的是，在HPLC‒DAD和UPLC‒MS/MS分析中，未检测到胆固醇（S12）、α-蜕皮激素（S13）和（+）-蜕皮激素（S14）在UGT80G40和41存在下的糖基化产物（补充信息图S46）。两种三萜类化合物，环达玛烷36和羽扇豆烷37，可以通过UGT80A40和41糖基化为其相应的单3-O-葡糖苷，而熊果酸型三萜类化合物38可以通过UGT80A40糖基化为其单3-O-葡糖苷，尽管这些反应的效率较低（补充信息表S8）。此外，香树烯类化合物39和40可以分别通过UGT80A40和UGT80A41转化为其单3-O-葡糖苷52和53（图2B和补充信息图S47）。从制备规模的酶促反应中纯化出酶促产物41、43--46和53，并通过HR-ESI-MS和NMR光谱分析解析其结构。化合物43、45、46和53为先前未描述的化合物，其结构通过2D NMR实验（包括1H‒1H COSY、HSQC、HMBC和ROESY）进一步确认。41、43‒46和53的HMBC光谱显示葡萄糖的H-1′/C-1′与苷元的C-3/H-3之间的1H‒13C远程相关性（补充信息图S48--S76），为所提出的结构提供了有力证据。化合物42和47--52通过UPLC‒MS/MS分析基于特征[M+H]+或[M+Na]+离子的存在进行初步鉴定（图S47），其中51和52为推测的未描述化合物。UGT80A40和41显示出对UDP-葡萄糖的特异性，因为当使用UDP-鼠李糖或UDP-阿拉伯糖作为糖供体以及麦角甾醇过氧化物（27）或topsentisterol D3（29）作为糖受体时，未检测到特异性产物。考虑到它们能够糖基化一系列植物和真菌甾醇，包括广泛存在的β-谷甾醇，以及广泛分布的植物环达玛烷、羽扇豆烷和熊果酸型三萜类化合物以及香树烯双萜类化合物，UGT80A40和41可被视为非常多功能的植物甾醇和三萜葡糖基转移酶，与糖-糖6′-O-葡糖基转移酶UGT91AH 1--3不同。
3.6 探索糖基转移酶的分子机制并鉴定对催化活性至关重要的残基
由于这些已鉴定的UDP-糖基转移酶显示出不同的糖受体和糖供体选择性以及区域特异性，我们研究了它们的催化机制。UGT80A40（具有葡糖基供体特异性）、UGT73CE1（具有鼠李糖供体特异性）和UGT91AH 1--3（具有糖供体多样性）的3D结构被建模（Hermite）。预测这些PpUGTs均采用GT-B折叠结构，包含两个分离但柔性连接的Rossmann样结构域，催化裂隙位于这两个结构域之间。多序列比对显示这些PpUGTs的C端Rossmann结构域中具有植物次级产物糖基转移酶（PSPG）特征性结构域（补充信息图S77）。对于UGT73CE1和UGT91AH 1--3，PSPG结构域中的W22、D/E43和Q44残基已被报道参与与糖供体的糖基形成氢键并被保留 。在UGT73CE1的PSPG结构域中的最后一个氨基酸被发现为Q，而非H。
UGT91AH 1--3模型中另一个保守的特征是糖受体5的5″-甲基基团与UGT91AH 1--3中Y187、F183和F180的芳香环之间的疏水相互作用（图4A），这可能通过稳定糖受体的2′-鼠李糖残基来促进β-(1→6)-糖基化。为了验证这一假设，分别将这些芳香族残基突变为更灵活的氨基酸，并创建了八个突变体。突变体UGT91AH1Y187A和UGT91AH1Y187M对6的β-(1→6)-葡糖基化活性增加，转换率分别为80%和68%，而原生UGT91AH1的转换率约为60%。然而，其他六个突变体的催化活性降低（图4B‒D，补充信息图S85和表S10）。结果表明，UGT91AH 1--3在β-(1→6)-糖基化的分子机制上存在差异，UGT91AH1Y187A和UGT91AH1Y187M的催化活性增加可能是由于灵活的氨基酸为糖受体留出了更大的空间。
进一步使用化合物15作为底物研究UGT91AH 1--3的底物识别和区域特异性，因为它可以被转化为两个酶促产物，即6′-O-葡糖基衍生物23a和6″-O-葡糖基衍生物23b。UGT91AH 1--3的H20A突变体显著减少甚至消除了23a的生成，但对23b的生成影响较小（图S85，表S10）。这些结果暗示PpUGT4-6可能通过不同的氨基酸来控制23a和23b的生成。由于该位点预测与6′-OH功能形成氢键，突变在此位点的强烈效应是可以预期的。其他突变体也表现出6′-O-糖基化活性显著下降，而6″-O-糖基化活性变化较小或略有增加（图4B‒D，图S85，表S10）。突变体UGT91AH1Y187A显示出独特的模式，23a形成的转换率增加了2.8倍，同时23b的形成明显减少，这可能反映了其相比原生UGT91AH1对底物6的催化活性增加（见前段）。
3.7. 滇重楼皂苷对三种皮肤癣菌和耐氟康唑白色念珠菌的抗真菌活性
考虑到传统医学中重楼用于治疗脓肿和溃疡的外用用途，我们评估了酶促甾体糖苷和其他代表性PSs对四种广泛分布的人类致病真菌株的抑制效果，包括三种常见的皮肤癣菌（红色毛癣菌、绵状表皮癣菌和石膏样小孢子菌）以及临床耐氟康唑的白色念珠菌株（补充信息图S86）。结果发现化合物S1、13、gracillin、PSI、PSII、PSV（5）、PSVI（6）、PSVII和PSH对三种皮肤癣菌表现出显著的抑制活性，MIC50值范围为0.07至24.08 μmol/L（表1）。特别是三糖苷产物13显示出明显的抗皮肤癣菌活性，其MIC50值远低于其双糖苷前体5。同时，发现PSI和PSII对红色毛癣菌表现出最强的抗真菌活性，该菌是全球皮肤癣的主要病原体，其MIC50值分别为0.12 ± 0.02和0.37 ± 0.01 μmol/L，分别比盐酸特比萘芬（MIC50 = 1.54 ± 0.03 μmol/L）强约12倍和4倍。gracillin和PSVII对红色毛癣菌的抗真菌活性与盐酸特比萘芬相当。化合物S2对绵状表皮癣菌和石膏样小孢子菌表现出中等的抗真菌活性，但对红色毛癣菌无活性。然而，化合物14和PSIII对三种皮肤癣菌均未显示出明显的抗真菌活性。针对临床耐氟康唑的白色念珠菌株，PSI、PSII、PSIII和PSVII表现出显著的抑制活性，MIC50值范围为1.79至8.84 μmol/L（表1）。此外，PSI、PSIII和PSVII显著地抑制了白色念珠菌生物膜的形成，并以剂量依赖性方式阻止其从酵母形态向菌丝形态的转变（补充信息图S87）。
| Compound | MIC50 (μmol/L) | |||
|---|---|---|---|---|
| T. rubrum | E. floccosum | M. gypseum | C. albicans | |
| 1 | -- | -- | -- | >100 |
| 3 | -- | -- | -- | >100 |
| 5 (PSV) | 18.76 ± 0.37 | 12.40 ± 0.69 | 6.89 ± 0.34 | 38.33 ± 0.08 |
| 6 (PSVI) | 24.08 ± 0.22 | 18.61 ± 1.19 | 14.28 ± 0.10 | 37.91 ± 0.05 |
| S1 | 3.91 ± 0.18 | 1.62 ± 0.03 | 2.18 ± 0.06 | >100 |
| S2 | >100 | 45.86 ± 5.25 | 33.07 ± 1.40 | >100 |
| 13 | 5.46 ± 0.23 | 2.41 ± 0.01 | 2.93 ± 0.18 | 51.20 ± 0.11 |
| 14 | >100 | >100 | >100 | >100 |
| Gracillin | 1.38 ± 0.03 | 0.31 ± 0.01 | 0.65 ± 0.001 | >100 |
| PSIII | >100 | >100 | >100 | 3.67 ± 0.05 |
| PSI | 0.12 ± 0.02 | 0.07 ± 0.001 | 0.09 ± 0.004 | 1.79 ± 0.03 |
| PSH | 3.55 ± 0.05 | 1.55 ± 0.04 | 2.01 ± 0.06 | 13.00 ± 0.05 |
| PSII | 0.37 ± 0.01 | 0.21 ± 0.02 | 0.12 ± 0.002 | 8.84 ± 0.98 |
| PSVII | 1.36 ± 0.003 | 1.46 ± 0.04 | 1.61 ± 0.007 | 5.80 ± 0.03 |
| Terbinafine hydrochloride/Amphotericin B | 1.54 ± 0.03 | 0.005 ± 0.0001 | 0.001 ± 0.0002 | 0.10 ± 0.001 |
破折号表示未测试抑制效果。特比萘芬盐酸盐和两性霉素B分别作为评估皮肤癣菌和白色念珠菌抑制活性的阳性对照。实验使用了一株临床耐氟康唑的白色念珠菌株。MIC50值以平均值±标准差（SD）表示。MIC50值低于或与阳性对照相当的结果在灰色框中突出显示。
结构-活性关系（SAR）分析表明，多糖基化有助于增强抗真菌活性，因为大多数含有二糖、三糖和四糖苷的甾体皂苷表现出显著的活性，而苷元薯蓣皂苷元（1）和薯蓣皂苷元-3-O-葡糖苷（3）则没有明显活性。C-2′位的鼠李糖基团在这类化合物的抗真菌活性中起重要作用，因为PSI和PSH的活性明显高于化合物S1和S2。PSs的C-4′位的阿拉伯糖基团似乎比葡糖基更重要，但在同一位置取代为鼠李糖基会显著降低活性，这是通过比较具有相同薯蓣皂苷元苷元和3-葡糖基、2′-鼠李糖基取代基的gracillin、PSI和PSIII的抗真菌活性得出的，它们在C-4′上的糖基化不同。进一步对4′-鼠李糖基的修饰显著提高了抗皮肤癣菌活性，但却降低了对耐氟康唑白色念珠菌的抑制活性，这可通过比较PSII和PSIII的抗真菌活性得出。有趣的是，甾体苷元的C-17位羟基化（如在东莨菪苷元中）显著减弱了对三种皮肤癣菌的抗真菌活性，这可通过比较化合物S1和S2、5和6、13和14、PSI和PSH，以及PSII和PSVII的抗真菌效果得出。然而，C-17羟基化对耐氟康唑白色念珠菌的抗真菌活性没有明显影响，因为PSV和PSVI以及PSII和PSVII表现出相似的活性。
我们还开始探索酶促产物13和活性最强的PSI对皮肤癣菌T. rubrum的作用机制。首先，我们评估了13和PSI对T. rubrum孢子萌发的抑制作用，因为孢子萌发是致病过程中的关键步骤，已被认为是抗真菌药物开发的一个有效靶点。结果显示，化合物13和PSI以剂量依赖性方式显著抑制了孢子萌发（图5A）。当孢子暴露于20 μmol/L的化合物13和2 μmol/L的PSI时，抑制率分别达到95.6%和96.7%。然而，当PSI浓度为0.25 μmol/L时，T. rubrum孢子的萌发未观察到明显的抑制效果，而此浓度约为MIC50值的两倍，暗示除了孢子萌发外，可能还有其他细胞过程参与。此外，我们评估了化合物13和PSI对细胞壁和细胞膜的作用，这些是许多抗真菌剂的主要靶点。通过渗透保护和细胞物质泄漏实验，确定13和PSI对T. rubrum细胞壁和膜完整性的影响。在存在渗透保护剂山梨醇的情况下，化合物13和PSI对T. rubrum的MIC值（分别为10和0.625 μmol/L）与单独使用化合物时的MIC值相同，表明这些化合物并未作用于细胞壁。然而，化合物13（40和80 μmol/L）和PSI（5、10和20 μmol/L）显著引起细胞内核酸的泄漏，且泄漏率随化合物浓度的增加而增加（图5B）。因此，化合物13和PSI可能参与了真菌细胞膜完整性或通透性的破坏。
图5. 酶促三糖苷产物13和PSI对红色毛癣菌的抗真菌活性 (A) 化合物13和PSI处理后红色毛癣菌孢子萌发的百分比。 (B) 化合物13和PSI处理后红色毛癣菌的细胞内物质释放率。 (C) 红色毛癣菌暴露于化合物13、PSI和特比萘芬盐酸盐（TH）后内源性麦角固醇含量。 (D和E) 扫描电子显微镜分析红色毛癣菌菌丝在对照（D）和PSI（E）处理下的情况。 (F和G) 透射电子显微镜分析红色毛癣菌菌丝在对照（F）和PSI（G）处理下的情况。 (H) 真菌中麦角固醇生物合成途径。红色标记的基因是PSI处理后上调的，黑色标记的基因未显示表达水平变化。 (I) 基因本体（GO）富集分析红色毛癣菌经PSI处理后差异表达基因（DEGs）的情况。数据以均值±标准误表示（每组n = 3）。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01对比对照组。
考虑到麦角固醇是维持真菌细胞膜完整性和功能的主要甾体成分，确定了化合物13和PSI对真菌麦角固醇含量的影响。然而，GC-MS分析显示，化合物13（20和40 μmol/L）或PSI（0.625和1.25 μmol/L）处理红色毛癣菌后，其内源性麦角固醇含量没有明显变化（图5C）。相反，暴露于特比萘芬盐酸盐导致红色毛癣菌内源性麦角固醇显著减少（P < 0.01），这一结果与先前报道的特比萘芬对麦角固醇生物合成的抑制作用一致。然而，外源性麦角固醇的加入削弱了化合物13和PSI的抗真菌活性。在250 μg/mL外源性麦角固醇存在下，化合物13和PSI的MIC值分别为40和20 μmol/L，分别是单独使用时MIC值的4倍和32倍（化合物13为10 μmol/L，PSI为0.625 μmol/L）。
为了进一步研究对细胞膜的作用，通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析了PSI处理的红色毛癣菌菌丝的超微结构。SEM分析显示，对照组红色毛癣菌菌丝表现为光滑、饱满且均匀的表面（图5D）。暴露于0.625 μmol/L的PSI后，红色毛癣菌菌丝变得凹陷和扭曲（图5E）。在TEM下，对照组红色毛癣菌菌丝表现出完整的细胞壁和细胞膜（图5F）。然而，PSI（0.625 μmol/L）处理导致菌丝细胞膜的破坏，而细胞壁保持完整（图5G）。细胞膜形态的变化与细胞内核酸泄漏一致，进一步表明PS暴露导致细胞膜受损。
对PSI处理的红色毛癣菌进行的RNA测序分析显示，除ERG1、ERG11、ERG6和ERG4上调外，大多数麦角固醇生物合成基因的表达没有明显变化（图5H），这表明PSs并非麦角固醇生物合成的抑制剂。差异表达基因（DEGs）的基因本体（GO）分析显示，PSI处理后基因表达变化最多的生物过程是跨膜运输，包括38个DEGs（图5I和补充信息图S88）。细胞膜是DEGs变化最多的细胞成分，而分子功能变化最多的是跨膜转运活性。前10个DEGs包括P型Na+/K+转运蛋白（下调）和ABC型转运蛋白（上调）。然而，PSI暴露对参与细胞膜组装的其他过程相关基因（如甘油磷脂代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定生物合成、鞘脂代谢和糖鞘脂生物合成）的表达没有明显影响。此外，压力反应、氧化磷酸化、糖酵解和三羧酸循环途径也未受到PSs的显著影响（补充信息图S89）。所有这些结果表明，PSI主要作用于真菌细胞膜，可能通过靶向麦角固醇来影响跨膜运输。
4. 讨论
糖基化是类固醇皂苷生物合成中的关键步骤，类固醇皂苷是一类结构独特的天然产物，是著名的中药材------重楼的主要活性成分。通过转录组和系统发育分析结合生化方法，我们成功鉴定了六种负责连续糖基化的PpUGTs，这些酶生成类固醇双糖苷和三糖苷，为通过植物或微生物代谢工程生产类固醇皂苷奠定了基础。UGT80A40和UGT80A41是甾醇3-O-β-葡糖基转移酶，负责将薯蓣皂苷元和东莨菪皂苷元转化为其相应的3-O-葡糖苷。接下来是UGT73CE1，一种类固醇糖苷2′-O-鼠李糖基转移酶，它将单糖苷转化为双糖苷PSV和PSVI。最后，UGT91AH 1--3是三种类固醇糖苷6′-O-葡糖基转移酶，进一步催化PSV和PSVI的6′-O-葡糖基化，生成三糖苷13和14。UGT91AH 1--3是首批功能性表征的属于UGT91亚家族的6′-O-葡糖基转移酶。UGT91亚家族的生化功能此前大多未知，只有少数鼠李糖基转移酶和2′-O-葡糖基转移酶被鉴定【50】【51】【52】。我们的发现揭示了该亚家族在糖-糖糖基化中的新区域特异性和糖供体利用。UGT80A40和41是近期发表的UGT80A33和UGT80A34的变体【39】，从不同的滇重楼种群中分离出来。它们的氨基酸序列和KM值的差异表明了该类群皂苷生物合成酶的多样性，这可能是重楼质量不稳定的主要原因之一。
根据所鉴定的UDP-糖基转移酶的产物和底物偏好性，现在可以提出PSs的糖基化步骤顺序。在类固醇苷元薯蓣皂苷元和东莨菪皂苷元的初始3-O-葡糖基化后，由UGT73CE1催化的2′-鼠李糖基化被认为是形成含有α-l-鼠李糖基-(1→2)-葡糖苷基团的主要PSs的第二糖基化步骤，因为UGT73CE1对类固醇单糖苷而非双糖苷的特异识别【12】。因此，PSs的糖基化组装过程与马铃薯中的类固醇糖生物碱不同，后者的2′-鼠李糖基化被认为是终末步骤【53】。由于UGT91AH 1--3更偏爱类固醇双糖苷而非单糖苷，6′-葡糖基化应在2′-鼠李糖基化之后进行。然而，由于空间位阻的原因，C-6′和C-4′的糖基化不能同时或连续发生，这就是为什么之前鉴定的PSs中仅含有6′-糖基或4′-糖基，而没有两者共存的【12】。有趣的是，UGT91AH 1--3在我们实验中产生的产物13和14尚未从重楼属中分离出来，尽管它们已经从近缘植物白百合和堪察加延胡索中分离出【54】【55】。考虑到这些植物的近缘关系，以及UGT91AH 1--3的亲和常数与其他植物UGTs相当，化合物13和14应该是重楼中的稀有类固醇糖苷，化合物14确实在所有组织中检测到，尤其是在根茎和须根中，而化合物13可能只在特定的生长阶段或特定的环境条件下产生。
鼠李糖基转移酶UGT73CE1表现出相对较低的糖受体选择性，能够接受无论C-17侧链有何变化的3-O-葡糖基类固醇，但不能利用类固醇双糖苷、三萜糖苷、双萜糖苷、单萜糖苷和黄酮单糖苷。然而，UGT73CE1的区域和糖供体特异性严格，该酶仅催化β-(1→2)-鼠李糖基化。相比之下，其他表征的葡糖基转移酶在糖受体上的表现出高度多样性。UGT91AH 1--3能够接受类固醇单糖苷和双糖苷，但不能接受类固醇三糖苷或四糖苷。UGT91AH 1--3的催化活性可以通过类固醇双糖苷中的2′-鼠李糖基存在得到增强，但4′-糖基的存在可能由于空间效应阻碍了β-(1→6)-葡糖基化。这些酶还糖基化三萜和双萜糖苷，但更偏好单糖苷而不是双糖苷。这与它们对类固醇糖苷的偏好（偏好双糖苷）不同，可能是由于活性口袋空间限制对糖受体的容纳。此外，UGT91AH 1--3除了UDP-葡萄糖外，还能利用UDP-鼠李糖和UDP-阿拉伯糖。UGT91AH 1--3的高底物多样性为未来的宝贵三萜皂苷的β-(1→6)-糖基化酶模板提供了可能性。UGT80A40和41也能糖基化一系列植物和真菌的甾醇、三萜和双萜类化合物。这项研究最终生成了一组24种萜类皂苷，包括15种先前未描述的化合物，基于这些已表征UDP-糖基转移酶的惊人底物多样性。
尽管表现出广泛的底物多样性，这些UDP-糖基转移酶在糖受体和糖供体的选择性上表现出不同的模式，这使得植物UGTs的分子机制研究成为可能。鼠李糖基转移酶UGT73CE1和葡糖基转移酶UGT91AH 1--3都利用组氨酸作为通用酸来活化糖受体的亲核羟基。分子对接和定点突变实验表明，尤其是与糖受体通过氢键或π堆积作用的芳香族残基对底物的识别或稳定至关重要。构建了具有更高催化效率的突变体UGT91AH1Y187A，这为UGTs的酶工程提供了一种有效策略。有趣的是，PpUGT 4--6能够向含有两个自由6-羟基的双萜糖苷添加两个葡萄糖，但控制这两个葡糖基添加的氨基酸不同。此外，UGT73CE1/UGT91AH1中的A145/L142、L146/F143和W239/E285残基似乎与糖受体相互作用，因此被认为对糖供体识别至关重要。然而，双突变体和单突变体均表现出催化活性的显著降低甚至丧失，强调了糖供体特异性识别是由蛋白质结构而非单一保守残基决定的【56】。
此外，我们首次发现大多数PSs对三种皮肤癣菌和耐氟康唑白色念珠菌表现出强效抗真菌活性，而这些真菌在全球范围内引发了难治性临床问题并导致发病率增加【57】【58】。特别是三糖苷产物13表现出明显的抗皮肤癣菌活性。同时，PSI和PSII对T. rubrum的抗真菌活性分别比抗真菌药物特比萘芬盐酸盐高出约12倍和4倍。结果支持了传统使用重楼治疗感染的经验。糖的组成、苷元类型和糖链的连接位点对PSs的抗真菌活性有很大影响，尤其是C-2′位的鼠李糖基团在强效抗真菌活性中起着重要作用。
渗透保护和核酸泄漏实验表明，PSs的抗真菌活性与真菌细胞膜的破坏有关，而不是细胞壁。TEM和SEM研究进一步证实了PSs在细胞膜上的主要作用。已有研究证明，最常用的抗真菌药物（包括唑类和多烯类）主要作用于细胞膜，或通过抑制麦角固醇的生物合成，或通过结合嵌入膜中的麦角固醇【59】【60】。然而，本研究中PSs并未影响内源性麦角固醇的含量，尽管T. rubrum的麦角固醇生物合成基因的表达上调。PSs对耐氟康唑白色念珠菌菌株的抗真菌活性进一步表明，PSs和唑类抗真菌剂的靶点不同。然而，根据在外源性麦角固醇存在下PSs抗真菌效果的降低，PSs的抗真菌活性仍然依赖于麦角固醇。麦角固醇生物合成基因的上调可能是对细胞膜损伤或PSs与麦角固醇结合的补偿反应。在结构上，PSs含有疏水性的苷元和亲水性的糖链，使其具备两性特性，这也是多烯类抗生素（如两性霉素B、制霉菌素和制霉素）的特征之一。PSs是否通过与麦角固醇结合并在细胞膜上打孔类似于两性霉素B的作用机制尚待研究。或者，PSs可能直接通过模仿麦角固醇融入真菌膜中，但苷元的无活性与这种假设相矛盾。PSs处理增强了GO生物过程中跨膜运输的富集，这进一步支持了这些化合物破坏细胞膜完整性和通透性的能力。因此，PSs可能成为开发针对T. rubrum的替代治疗策略的有前途候选药物。这个课题显然需要进一步深入研究，以了解这种著名中药成分的作用机制。
结论
总之，我们功能性鉴定了参与滇重楼类固醇苷元连续糖基化生成三糖苷的六种UDP-糖基转移酶。我们揭示了这些UDP-糖基转移酶的催化特异性及其惊人的底物多样性，并通过分子对接和定点突变实验展示了对酶活性至关重要的催化残基及机制。我们首次发现，包括三糖苷产物13在内的大多数重楼皂苷对三种广泛存在的人类皮肤癣菌病原体及临床耐氟康唑的白色念珠菌菌株表现出强效抗真菌活性。这类天然产物通过依赖麦角固醇的机制破坏真菌细胞膜。总体而言，我们的研究表明，滇重楼中的类固醇皂苷是治疗皮肤癣菌感染及耐氟康唑白色念珠菌感染的潜在新型抗真菌剂，这六种PpUGTs为利用合成生物学或酶促方法操控皂苷生产、开发新药提供了宝贵的催化工具。