A Real-Time Cross Correlator for Neurophysiological Research

A Real-Time Cross Correlator for Neurophysiological Research

DAVID W. ARNETT AND BEN M. ELLERT

Abstract---本文描述了一种用于计算神经元脉冲序列互相关图的仪器。该仪器的专用特性使其具备足够的计算速度，能够实时显示互相关图的绘制过程。这种能力极大地扩展了研究人员在从多个神经单位收集数据的关键阶段的观测能力。由于采用模块化设计，可轻松设计并集成其他有用的统计分析程序（如刺激后时间直方图PST、间隔直方图INT）。

一、引言

三十多年来，单单位分析方法已使神经生理学家能够在细胞水平上收集大量关于神经系统行为的信息。这促成了许多重要发现；然而，大多数人认为，仅观察复杂神经系统中每个单单位的行为并不足以理解整个系统的行为。在这种情况下，部分的总和并不一定等于整体，因为长期以来人们一直认识到，信息是由神经元群体承载和处理的。这种群体信息无法通过一次研究单个信息来完全理解。

神经生理学家意识到单单位分析的局限性，并将单单位分析方法与其他方法相结合，以从神经系统中获取更全面的信息。最有前景的结合方式之一是通过单个神经细胞的细胞内染色技术，将单单位分析与神经解剖学相结合。另一种方法------多脉冲序列分析------虽然并非新方法，但在我们看来尚未充分发挥其潜力。多脉冲序列分析不仅能提供关于群体信息的内容，还能推断单位之间的功能相互作用。

尽管同时记录两个或多个神经元的能力以及此类数据分析理论已存在十多年，但它们的应用范围相当有限。这可能有几个原因：首先，单单位分析足以回答许多重要问题，因此人们对多单位数据的关注较少；其次，尽管分析理论已经存在，但在检验效应的显著性方面并不完善，更重要的是，无法对结果进行唯一解释；第三，多单位分析需要使用相当复杂的基于计算机的数据分析系统。

显然，第一个原因在某种程度上可能仍然存在；然而，随着人们对神经环路的兴趣日益浓厚，更多的注意力将投向能够提供功能连接信息的方法，如多单位分析。第二个原因次要一些，因为可以进行经验性的显著性检验，并且基于实验者通常掌握的其他信息，能够做出合理的解释。如今，大多数研究人员都拥有实验室计算机，或者可以使用更大的计算机，这就消除了第三个原因。

多脉冲序列中包含的信息利用率较低还有另一个原因，即难以证明同时记录的单位对之间存在显著的统计依赖性。显然，记录两个同步脉冲序列并不困难；但难点在于找到两个表现出显著统计依赖性的单位。这种情况很可能仅当单位之间的突触间隔不超过2-3个时才会出现，这极大地限制了该分析能够提供有效信息的单位对类别。事实上，任意选择的两个单位存在显著统计依赖性的概率接近于零。

只有在非常特殊的情况下[1]、[2]、[3]，或者在特殊的搜索条件下（如Cleland等人[4]所使用的方法），才能通过两个独立电极证明统计依赖性。由于物理位置相近的神经细胞更有可能存在功能连接，因此，如果不使用两个独立的微电极，而是仅使用一个微电极来记录多个可分离的单位，可能会更快捷地获得阳性结果。当然，这引入了从多单位记录中分类和分离单位的问题，本文对此不做讨论。无论如何，必须进行高效搜索，这就需要一种快速测试两个脉冲序列（无论来自一个还是多个电极）之间统计依赖性的方法。

为了加快对统计依赖性脉冲序列的搜索，我们设计了一种能够实时计算和显示两个脉冲序列互相关图的仪器。此前[1]、[2]、[3]、[5]、[6]，统计依赖性测试都是离线进行的，如果测试结果为阳性，往往无法进行进一步研究。换句话说，当实验数据评估完成时，实验已经结束，因此无法更详细地深入研究这些阳性发现。由于我们的装置是"硬连线"专用仪器，其速度远快于编程适当的实验室计算机。因此，我们设想它在实验数据收集的"预分析"阶段具有首要重要性。这样，如果显示出阳性结果，就可以开展更细致的研究，随后在大型离线计算机上进行更严格的分析。本质上，该仪器是实验室示波器的扩展，因为它增强了实验者的观测能力。除了互相关分析外，它还能实时绘制和显示刺激后时间直方图（PST）和间隔直方图（INT），并且由易于获取的低成本集成电路构成。

二、互相关分析

在讨论仪器的基本设计之前，有必要简要回顾互相关分析的一些理论[7]。众所周知，单个神经细胞能够通过沿轴突传导全或无的脉冲，在长距离上传递信息。单个细胞中传递的信息通过脉冲产生的时间历程进行编码；因此，通过记录每个脉冲发生的时间，可以完整描述单个神经元传递的信息。该表述中隐含的假设是：单个细胞中的所有脉冲都是相同或不可区分的，并且它们是瞬时事件。因此，单个细胞的脉冲序列可以通过每个脉冲或事件的发生时间（T.O.E.）序列进行数学表达。图1（a）展示了两个同时记录的脉冲序列，图1（b）展示了相应的事件发生时间（T.O.E.）序列。

基于事件发生时间（T.O.E.）序列可以进行各种数学计算，互相关就是其中之一。脉冲序列A和脉冲序列B之间的互相关 R A B ( τ ) R_{A B}(\tau) RAB(τ)可定义为：
R A B ( τ ) = lim ⁡ δ → 0 1 δ P r o b ( 事件B发生在 [ τ , τ + δ ] 内 ∣ 事件A发生在时间0 ) R_{A B}(\tau)=\lim _{\delta \to 0} \frac{1}{\delta} Prob (\text{事件B发生在} [\tau, \tau+\delta] \text{内} | \text{事件A发生在时间0}) RAB(τ)=δ→0limδ1Prob(事件B发生在[τ,τ+δ]内∣事件A发生在时间0)

通常，互相关 R A B ( τ ) R_{A B}(\tau) RAB(τ)是通过绘制脉冲序列A和脉冲序列B中所有事件之间交叉间隔的直方图（互相关图 R ^ A B ( τ ) \hat{R}_{A B}(\tau) R^AB(τ)）来估计的。如果每个脉冲序列中有5000个事件，则需要计算和统计2500万个间隔以形成互相关图。通常，并非所有交叉间隔都是必需的。尽管如此，仍需要一台大型高速计算机。

另一种方法以灵活性为代价简化了计算，该方法通过二进制序列而非事件发生时间（T.O.E.）序列来表示脉冲序列。具体做法是将时间量化为多个区间（bin），如果某个区间内发生脉冲，则记录为1，否则记录为0。图1（c）示意性地展示了这一过程。需要注意的是，区间宽度（ Δ T \Delta T ΔT）必须足够小，以确保每个区间最多出现1个脉冲。尽管二进制表示法特别适合使用标准逻辑电路进行分析，但灵活性较低，因为事件发生时间（T.O.E.）序列可以转换为二进制序列，反之则不行，并且分析的区间宽度由二进制表示法的区间宽度固定。

使用二进制表示法可以轻松估计互相关。如果将二进制序列A向右移位k个区间，并统计序列A中的1与序列B中的1重合的次数（ N k N_{k} Nk），则 N k / N A N_{k} / N_{A} Nk/NA（其中 N A N_{A} NA是脉冲序列A中的事件总数）提供了在事件A发生于时间0的情况下，事件B发生在区间 [ k Δ T , ( k + 1 ) Δ T ] [k \Delta T, (k+1) \Delta T] [kΔT,(k+1)ΔT]内的概率估计。互相关图左侧的值通过将二进制序列A向左移位（或等效地将二进制序列B向右移位）获得。

由于两个脉冲序列的观测长度是有限的，因此互相关图的范围也必须受限。事实上，由于物理因素的考虑，通常移位超过某个极限的互相关图中几乎不包含任何信息。因此，将互相关图的范围截断为原点两侧各N个区间，几乎不会丢失信息。

三、设计

基于二进制序列表示法的上述算法可以使用易于获取的TTL逻辑电路实现。计算互相关图所需的基本操作如图2所示。考虑到所分析数据的物理特性和硬件因素，选择了8位字长。两个被称为回溯寄存器（look-back registers）的存储器用于存储脉冲序列A和B的二进制表示，这些存储器由两个128位长的1位移位寄存器组成，并由主时钟以固定速率持续更新。

图1 脉冲序列的数学表示。（a）两个同时记录的脉冲序列。（b）基于事件发生时间（T.O.E.）的脉冲序列数学表示。（c）基于二进制序列的脉冲序列数学表示。

图2（a）中的流程图描述了互相关计算过程中的事件序列。时间由主时钟量化，主时钟的周期可选择为互相关图的区间宽度。当主时钟脉冲到来（标志着一个区间的结束和新区间的开始）时，A和B二进制序列的当前值（1/0）被传输到缓冲器。随后，回溯寄存器用这些缓冲器位的内容更新，回溯寄存器中最久远的位被直接丢弃。互相关图的计算通过将回溯寄存器的输出与相应的缓冲器位进行"与"运算（ANDing）实现。这一步骤如图2（b）和（c）所示。"与"门的输出表示重合事件的发生，这些输出被累积到主存储器中，形成互相关图。重合计算（"与"运算）一直进行到回溯寄存器完全循环一次，此时对缓冲器位中存储的当前区间值的互相关计算完成。

允许的最小区间宽度（主时钟周期）为0.1毫秒，这对于大多数用途来说无疑提供了足够的分辨率。由于设计简单且硬件速度快，每个循环周期大约消耗200纳秒，因此完成一次互相关周期仅需25.6微秒。这使得主时钟脉冲之间有相当多的时间用于其他用途。事实上，互相关周期完成后，控制权将转移到显示主存储器中当前的互相关图。一旦新的主时钟脉冲到来，控制权将（通过中断）切换回互相关器。因此，可以实时显示互相关图的累积过程。

实现该互相关算法所需的核心电路如图3所示。 D A T A 1 DATA_1 DATA1和 D A T A 2 DATA_2 DATA2的输入信号是与脉冲序列A和B中事件发生对应的逻辑电平脉冲，由单独的脉冲鉴别器电路提供。 D A T A 1 DATA_1 DATA1和 D A T A 2 DATA_2 DATA2输入线上的脉冲出现会触发一个触发器，指示当前区间内发生了脉冲。当主时钟启动一个新区间时，这些触发器中存储的数据被传输到缓冲器A和B，随后传输到128位移位寄存器（回溯存储器）。如果任一缓冲器位为1，则需要进行重合计算，并启动循环周期。主存储器分为两部分，每部分包含128个8位字，7位计数器同时对主存储器的两部分进行寻址，当检测到重合事件时，存储器中的内容加1。

除了绘制互相关图外，无需过多额外的工作量或成本，即可添加用于绘制刺激后时间（PST）和间隔（INT）直方图的电路。PST电路如图4所示，支持三种PST直方图累积模式：首先，可以绘制两个同步的PST直方图（每个128个区间），对应于两个同时记录的脉冲序列的响应；其次，可以绘制一个256个区间的单个PST直方图；第三，可以绘制两个PST直方图（每个128个区间），对应于单个脉冲序列对交替呈现的不同刺激（如光点、环形光）的响应。

图2 互相关图计算相关操作的示意表示。（a）基本电路算法的流程图。该图仅用于帮助理解所涉及的一般过程，并不一定反映电路设计的精确特性。（b）和（c）循环周期中重合计算涉及的逻辑操作。

图3 互相关电路的基本逻辑图。

图4 PST电路的基本逻辑图。

如图4所示，PST电路的操作非常简单。基本上，刺激输入脉冲的出现会初始化数据计数器和地址计数器，它们分别用于统计每个区间内的事件数量和区间编号（存储器地址）。当主时钟发出定时脉冲时，数据计数器中的内容被添加到主存储器的相应计数中，地址计数器加1。PST模式控制电路控制上述三种PST模式的执行。与互相关分析类似，当PST/INT直方图硬件不需要使用主存储器时（大多数时间都是如此），控制权将切换到显示存储器中当前的直方图状态。

存储器中的内容通过依次查询每个存储单元并在相邻值之间绘制线条来显示。图5展示了基本操作流程。8位计数器包含阴极射线管（CRT）电子束位置的X坐标。显示格式化器通过反转一个存储器段来修改该坐标值，使互相关图能够以常规方式显示。如果8位计数器递增到新的坐标，则查询新存储单元的内容并放入输入寄存器。该值对应于要显示的新Y坐标，并与上下计数器中包含的当前Y显示坐标进行数字比较。根据新Y坐标和当前Y坐标的相对大小，上下计数器将按照显示时钟设定的速率递增或递减。因此，将在阴极射线管（CRT）上绘制一条垂直线，直到当前Y坐标值（上下计数器）等于新Y坐标值（输入寄存器），此时8位计数器递增，从而在阴极射线管（CRT）上绘制一条水平线，整个过程重新开始。由于所有线段都以相同的速率绘制，因此阴极射线管（CRT）轨迹的亮度均匀。显示时钟实际上由两个振荡器组成：200千赫兹的时钟用于绘制垂直线和水平线，50赫兹的时钟将显示刷新率限制在50帧/秒。除了需要大量垂直绘制的极端情况外，不会出现闪烁现象。

图5 显示和存储电路的基本逻辑图。

仪器的整体配置如图6所示。尽管未详细讨论，但定时和控制部分主要由主时钟和一个存储地址门组成，该存储地址门用于控制哪个部分（互相关Corr、刺激后时间/间隔PST/INT、显示Display）可以访问存储器。操作控制极其简化，包括启动、停止和清除开关、区间宽度选择器以及程序选择器（互相关Corr、刺激后时间PST、间隔INT、绘图Plot）。在绘图模式下，通过降低显示时钟速率并使用X-Y绘图仪绘制存储器中的内容，可以获得硬拷贝。

图6 仪器基本配置，展示重要信号路径。双线路径表示8位数据线。

四、应用

该仪器已用于研究猫背外侧膝状体核中同时记录的单位之间的统计依赖性。由于如果不进行某种形式的平均，几乎无法检测到大多数统计依赖性，因此该仪器在实际数据收集过程中被证明具有不可估量的价值。一旦同时观察到两个单位，就会累积它们的互相关图；如果互相关图显示存在统计依赖性，则收集更多数据，否则寻找其他单位组合。以这种方式使用该仪器，极大地提高了原本较低的搜索效率。

作为其应用示例，使用两个独立的微电极同时记录了苍蝇视叶中的两个方向选择性运动检测单元。图7（a）展示了这些单位对光点在视野中水平移动（首先从左到右，然后反向，如箭头所示）的响应。图7（b）展示了这些单位在黑暗中自发放电的情况，同时绘制了自相关图和互相关图。仔细观察自发放电记录可以发现，每个轨迹中都有两个不同的单位。尽管微电极从大脑的相对两侧进行记录，但每个轨迹中的较小单位与另一个轨迹中的较大单位几乎同步。最近已对这种有趣的情况进行了全面研究[3]。由此产生的相关图分析显示，如图7（c）和（d）中的自相关图相对平坦所示，两个脉冲序列中均未出现明显的周期性。

然而，图7（e）的互相关图中偏离平坦性的显著偏差表明，单位A和单位B之间存在强烈的统计依赖性。该互相关图的特征强烈暗示存在相互抑制作用。有趣的是，在发现这些类型的单位之间存在显著相互作用后，尽管存在难度，但通过使用专门触发的存储示波器可以直接观察到这种依赖性。然而，如果不知道要寻找什么，没有某种形式的平均，这种效应很可能永远不会被观察到。

图7 苍蝇视叶中两个同时记录的方向选择性运动检测单元的相关图分析。（a）两个单位对光点在视野中移动的典型响应。箭头指示运动方向。（b）两个单位在黑暗中的自发活动。注意每个轨迹中出现的较小单位，它们与另一个轨迹中的较大单位一一对应。（c）自发放电条件下单位A的自相关图（ N A = 2851 N_{A}=2851 NA=2851， Δ T = 2 \Delta T=2 ΔT=2毫秒）。（d）自发放电条件下单位B的自相关图（ N B = 3796 N_{B}=3796 NB=3796， Δ T = 2 \Delta T=2 ΔT=2毫秒）。（e）自发放电条件下单位A和单位B的互相关图（ N A = 4142 N_{A}=4142 NA=4142， N B = 6895 N_{B}=6895 NB=6895， Δ T = 2 \Delta T=2 ΔT=2毫秒）。（c）、（d）和（e）中的纵坐标为重合事件数。

图8（a）和（b）中的结果来自猫的两个膝状体单位，它们表现出非常不同的自发放电模式。（a）中的单位没有表现出周期性自发放电行为的趋势，而（b）中的单位的自发放电非常规律且具有高度周期性，这一点通过间隔直方图和自相关图均能体现。需要注意的是，从间隔直方图的特征可以看出，尽管存在一个周期约为20毫秒的强烈节律成分，但并非每个周期都会引发脉冲；相反，经常会出现两个或多个周期过去而没有引发脉冲的情况。图7和图8中的直方图使用现有的X-Y绘图仪绘制，为清晰起见，直方图下方的区域被涂黑。

图8 猫的两个膝状体核单位的间隔直方图和自相关图。（a）中心兴奋型膝状体（LGN）单位自发放电的间隔直方图和自相关图。（b）表现出明显周期性的中心兴奋型膝状体（LGN）单位自发放电的间隔直方图和自相关图。注意，偏好间隔出现在约20毫秒的倍数处。除（a）中的自相关图（区间宽度 Δ T = 1 \Delta T=1 ΔT=1毫秒）外，其他直方图的区间宽度（ Δ T \Delta T ΔT）均为0.5毫秒。

五、讨论

与用于绘制刺激后时间（PST）直方图的装置一样，本文描述的脉冲序列互相关器在数据收集的关键时期为实验者提供了更强的观测能力。希望该仪器的使用能够使研究人员充分利用多脉冲序列分析所提供的一些潜力。该仪器的实时计算和显示能力为评估脉冲序列行为的平稳性提供了独特的机会。例如，当猫的许多视网膜神经节细胞处于中等强度的光背景环境中时，会表现出显著的放电周期性。对于大多数细胞来说，节律周期会随着时间逐渐延长，脉冲间间隔的波动会大大增加，直到呈现出非周期性行为。通过实时显示累积的自相关图或间隔直方图，可以清晰地追踪这一系列事件。

在绘制用单个电极同时记录的两个单位的互相关图时，发现了该脉冲序列互相关器的一个未预期用途。分析用单个电极记录的多单位数据时会遇到几个问题，其中之一无疑是难以评估脉冲分离方法的可靠性。研究发现，实时互相关图对分类错误特别敏感，但对不太重要的遗漏错误不敏感。如果偶尔出现分类错误，它们将在互相关图中表现为接近零的峰值。由于任何偏离平坦性的情况（真实的或人为的）都值得关注，因此会特别关注偏离的原因。一般来说，由分类错误引起的偏离往往是"紧密的"，而真实的偏离不会因脉冲分类器的调整而变化。因此，如果互相关图随着脉冲分离策略的改变而变化，则该偏离很可能是由分类错误引起的，这通常可以通过仔细的示波器观察来验证。

由于其本质上的模块化配置，该仪器具有相当高的灵活性。除了互相关图和刺激后时间（PST）直方图外，还可以轻松设计并向系统中添加其他计算程序。例如，可以构建一个包含8位模数（A/D）转换器和相应逻辑的程序模块，并将其插入仪器中，用于绘制采样模拟平均值。尽管当前仪器中未包含，但集成用于控制存储地址的三态逻辑门将极大地促进其他程序模块的添加。由于其固有的灵活性，还可以通过适当的门控互相关器，仅在刺激周期的特定时段计算互相关图。因此，可以轻松测试离散刺激对神经元之间统计依赖性的影响。

完整的仪器包含146个TTL逻辑集成电路，其中32个构成存储器，这些存储器可能可以用单个集成电路替代。完整仪器（不包括电源和显示阴极射线管（CRT））的成本约为360美元。

专业术语表

英文术语	中文译法	缩写
Cross correlator	互相关器	-
Neurophysiological research	神经生理学研究	-
Neuronal spike train	神经元脉冲序列	-
Correlogram	相关图	-
Real-time display	实时显示	-
Single unit analysis	单单位分析	-
Neuroanatomy	神经解剖学	-
Intracellular staining	细胞内染色	-
Functional interaction	功能相互作用	-
Statistical dependence	统计依赖性	-
Time of occurrence	事件发生时间	T.O.E.
Binary sequence	二进制序列	-
Crosscorrelation	互相关	-
Bin width	区间宽度	-
TTL logic	TTL逻辑电路	-
Shift register	移位寄存器	-
Master clock	主时钟	-
Buffer	缓冲器	-
AND gate	与门	-
Main memory	主存储器	-
Post stimulus time histogram	刺激后时间直方图	PST
Interval histogram	间隔直方图	INT
Cathode ray tube	阴极射线管	CRT
Look-back register	回溯寄存器	-
Coincidence computation	重合计算	-
Analog-to-digital converter	模数转换器	A/D converter
Tri-state logic gate	三态逻辑门	-
Dorsal lateral geniculate nucleus	背外侧膝状体核	-
Directionally selective motion detection unit	方向选择性运动检测单元	-
Optic lobe	视叶	-
ON-center LGN unit	中心兴奋型膝状体单位	-
Retinal ganglion cell	视网膜神经节细胞	-
Stationarity	平稳性	-